BMP-7/Smad1/5/8 信号通路在肾缺血后处理减轻大鼠肾缺血再灌注损伤中的作用*

张 舒，李 然，徐先知，黄元宏，夏安周

徐州医科大学药理学教研室，徐州 221004

急性肾损伤（acute kidney diseases，AKI）是临床常见的急危重症，具有较高发病率和死亡率，并可能参与慢性肾脏疾病的发生和发展[1]。肾缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是引起AKI 最常见的原因，在临床上常见于休克后微循环再通、肾移植、弥散性血管内凝血等[2]手术过程中，严重时可引起急性肾功能衰竭。因此，如何减轻肾缺血再灌注损伤一直是肾脏病领域的研究热点。

缺血后处理（ischemic postconditioning，IPostC）是近年发现的一种重要内源性保护机制，即长时间缺血后再灌注前短时间内反复短暂再缺血处理，可明显减轻缺血组织的缺血-再灌注损伤。多项研究已经证实，肾IPostC 对肾脏缺血再灌损伤具有明显的保护作用[3]，但其确切机制仍不十分清楚。骨形态发生蛋白-7（bone morphorgenetic protein-7，BMP-7）在肾脏发育以及急、慢性肾脏损伤修复过程中起着重要的作用[4]。Smads 蛋白家族是BMP 信号转导通路中重要的胞浆递质，有研究表明，BMP-7 的肾保护作用与激活Smad1/5/8 信号通路密切相关[5]。子宫敏感性相关基因-1（uterine sensitization associated gene-1，USAG-1）是肾脏中表达丰富的BMP-7 拮抗剂，有研究结果发现，USAG-1 与许多肾脏疾病的发生发展以及预后密切相关[6]。

本研究采用大鼠肾IRI 模型，观察肾IPostC 时肾组织中BMP-7/Smad1/5/8 信号通路活性以及BMP-7 拮抗剂USAG-1 表达的变化，初步探讨BMP-7/Smad1/5/8 信号通路在肾IPostC 减轻肾缺血再灌注损伤中的作用，为临床肾缺血再灌注损伤的防治提供理论基础和治疗策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重200～250 g，购自山东济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK（鲁）2018 0003。

1.1.2 试剂 血肌酐（SCr）试剂盒（CO11-1）和尿素氮（BUN）试剂盒（CO13-2）购自南京建成生物有限公司；BMP-7 多克隆抗体（ab56023）和USAG-1 多克隆抗体（ab99340）购自英国ABCAM 公司；p-Smad1/5/8 单克隆抗体（13820P）购自美国CST 公司；GAPDH 单克隆抗体（TA-08）购自北京中杉生物技术有限公司；山羊抗小鼠荧光二抗（V926-32210）和山羊抗兔荧光二抗（V926-32211）购自微科曼得生物工程有限公司；TUNEL 试剂盒（一步法）（C1008）购于碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 SD 大鼠随机分为假手术组（sham组）；缺血再灌注损伤组（IR 组）；缺血后处理组（IPostC 组）。每组又按再灌注不同时间分成再灌注1.5、3、6、12、24 h 共五个时间点亚组。每组6 只大鼠。

1.2.2 动物模型的制备及取材 sham 组大鼠称重后腹腔注射10%水合氯醛麻醉（0.3～0.35 mL/100 g），麻醉后俯卧位固定于手术台架上，于大鼠左侧肋腰点下行纵向切口，充分暴露左侧肾脏，使用玻璃分针分离左侧肾脏肾蒂，60 min 后关腹缝合。IR 组手术方法基本同sham 组，分离左侧肾脏肾蒂后，夹闭左侧肾蒂60 min，然后松开动脉夹，制备肾脏缺血再灌注损伤模型。IPostC 组操作同IR 组，恢复灌注前给予6 个循环10 s 再灌注/10 s 缺血处理，然后恢复灌注。动物处死前腹主动脉采血3 mL，上下轻轻颠倒混匀3～5 次，4 ℃下3000 r·min-1离心15 min，吸取血清并分装，-80 ℃保存。动物处死取左肾，然后沿冠状面将其切成背、腹两个部分，腹面肾分装于冻存管，-80 ℃冻存备用（用于Western Blot），背侧面置于4%的多聚甲醛固定24 h 以上，后依次进行脱水、透明、浸蜡，制成石蜡包块，制备肾组织切片。

1.2.3 肾功能的测定 分别采用苦味酸比色法和脲酶-波氏显色法测定大鼠SCr 和BUN 水平，检测步骤按试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 细胞凋亡检测 切片依次在二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各脱蜡5～10 min，分别加100%、95%、80%、70%乙醇各5 min，纯水2 min；滴加20 μg·mL-1不含DNase 的蛋白酶K，20 ℃～37 ℃反应15～30 min；PBS冲洗10 min×2 次；加免疫染色强力通透液（P0097），室温孵育5 min；PBS 冲洗10 min×2 次；在每个样品上加入50 μL 含TdT 酶、荧光标记液的TUNEL 检测液，37℃避光孵育60 min；PBS 冲洗10 min×2 次；DAPI 染色1 min；PBS 冲洗10 min×2 次；用抗荧光淬灭剂封片后于荧光显微镜下观察细胞凋亡。细胞核呈亮绿色荧光即阳性细胞，每个样本观察5 个互不重叠的高倍镜视野，凋亡细胞核数与总细胞核数之比即为肾小管上皮细胞凋亡指数（AI）。

1.2.5 蛋白免疫印迹检测 BMP-7、USAG-1、Smad1/5/8 蛋白表达按照RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制剂=100∶1∶1 的比例配制裂解液，按照裂解液（mL）∶组织重量（mg）=10∶1 的比例作冰浴匀浆；冰上裂解30 min后12000×g、4 ℃下离心15 min；吸取上清液至离心管中，并用BCA 蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度；在测完浓度的蛋白样本中加入上样缓冲液×5，于沸水中变性5～10 min；取样品蛋白（60～80 μg）在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，半干转至硝酸纤维素膜上，转膜后用3%BSA 封闭液于摇床上摇动2 h，加入BMP-7（1∶1000）、USAG-1（1∶1000）或p-Smad1/5/8（1∶1000）一抗，置于4 ℃摇床中过夜；第二天室温平衡30 min 后，Washing buffer 洗涤5 min×3 次，加入山羊抗兔IgG，稀释比例为1∶10000，避光下室温孵育2 h 后，Washing buffer 避光洗涤5 min×3 次，最后一次用PBS 避光洗膜，以去除残留的吐温；用滤纸吸干NC 膜上残留液体，激光成像系统扫描NC膜，将所得条带图像用Image J 软件进行灰度分析。以BMP-7、USAG-1、p-Smad1/5/8 与GAPDH 光密度的比值表示目的蛋白相对表达含量。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0 统计软件作数据处理，所有数据以均数±标准差（）表示，数据符合方差齐性的采用单因素方差分析（one-way ANOVA），多组间比较LSD 检验；若数据不符合方差齐性，则采用Dunnett’s T3 检验。假设检验水准按α=0.05 判定。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾IPostC 对大鼠SCr 和BUN 含量影响

与sham 组相比，IR 组各时间点SCr 和BUN 的水平均明显增高，差异具有统计学意义（P<0.05）；与IR 组各对应时间点相比，IPostC 组SCr 和BUN 的水平均显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.2 肾IPostC 对肾组织BMP-7 和USAG-1 蛋白表达的影响

图1 各时间点大鼠SCr（A）和BUN（B）比较（，n=6）

免疫印迹检测结果见图2。sham 组BMP-7 蛋白高表达；IR 组各时间点BMP-7 蛋白表达量均低于sham 组，差异具有统计学意义（P<0.05），且表达水平随再灌注时间延长而逐渐下降，再灌注6 h 水平最低，随后逐渐升高，再灌注24 h 仍低于sham 组水平；与IR 组对应时间点相比，IPostC 组各时间点BMP-7 表达均显著升高，差异均具有统计学意义（P<0.05），且呈现先升高后逐渐降低的双向变化趋势，其中3h 时间点升高最明显（图2A、B）。sham 组有少量USAG-1 蛋白表达；与sham 组相比，IR 组再灌注各时间点USAG-1 蛋白表达水平均明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05），且随再灌注时间延长，其表达水平逐渐升高，再灌注6 h 达到高峰，随后逐渐降低，再灌注24 h 仍明显高于sham 组；与IR 组对应时间点相比，IPostC 组USAG-1 表达均显著降低，差异均具有统计学意义（P<0.05），见图2C、D。

2.3 肾IPostC 对肾组织p-Smad1/5/8 蛋白表达的影响

免疫印迹检测结果见图3。与sham 组相比，IR组24 h 时间点p-Smad1/5/8 蛋白表达有所下调，差异具有统计学意义（P<0.05）；与IR 组相比，IPostC组p-Smad1/5/8 蛋白表达明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.4 肾IPostC 对细胞凋亡的影响

sham 组肾组织中仅见个别肾小管上皮细胞凋亡；与sham 组相比，IR 组再灌注12 h、24 h 肾小管上皮细胞的凋亡较多，AI 增高（P<0.05）；与IR 组对应时间点相比，IPostC 组肾小管上皮细胞凋亡明显减少，AI 较低。结果见图4A、B。Pearson 相关分析结果显示，p-Smad1/5/8 和凋亡指数AI 存在显著负相关，相关系数r 为-0.855（P<0.05，见图4C）。

3 讨论

图2 肾IPostC 对大鼠肾组织BMP-7 和USAG-1 蛋白表达的影响（，n=3）

图3 肾IPostC 对肾组织p-Smad1/5/8 蛋白表达的影响（，n=3）

图4 肾IPostC 对细胞凋亡的影响（，n=3）

肾挤压伤、肾实质切开取石、肾肿瘤行部分肾切除术和肾脏移植等手术时，均可能发生IRI[2]，严重时可导致急性肾功能衰竭。IPostC 对肾脏IRI 有一定的保护作用，但确切机制尚不清楚。因而建立理想的实验动物模型是研究肾IRI 发生机制以及IPostC 产生保护作用机制的关键环节。本实验结果显示，肾缺血60 min 后给予大鼠6 个循环10 s 再灌注/10 s 缺血处理，大鼠SCr 和BUN 的水平明显降低，进一步证实IPostC 可以有效地改善肾功能。对此解析肾IPostC 减轻肾IRI 似有如下原由：

BMP-7 是TGF-β1 超家族成员之一，在多种急、慢性肾脏疾病模型中，均发现肾组织中BMP-7及其受体的表达明显下调，且随着疾病进程而加重，当肾损伤恢复时BMP-7 的表达水平可以恢复到基准线水平[7]。当给予外源性BMP-7 则能减轻急、慢性肾损伤，加速肾功能的恢复和受损组织的修复[8]。本研究发现，IPostC 能明显提高了大鼠肾IRI 后肾组织BMP-7 蛋白表达，其中以再灌注3 h 和6 h 升高最为明显。故推测肾IPostC 可通过上调肾组织BMP-7 蛋白的表达而发挥其内源性保护作用。

近年来有关研究发现，内源性BMP-7 的活性不仅受其自身表达的影响，也受其拮抗剂的调节。另有研究发现，USAG-1 是大鼠肾中表达最丰富的BMP-7 特异性拮抗剂[7]。本实验显示，与BMP-7 变化趋势不同，IR 组USAG-1 蛋白的表达水平均随着再灌注时间的延长而上调。相反的是，与IR 组各对应时间点相比，IPostC 组USAG-1 蛋白的表达水平明显降低。由此判断，肾IPostC 除了上调BMP-7 表达外，还可通过下调肾组织BMP-7 内源性拮抗剂USAG-1 的表达，进而增强BMP-7 的生物学活性。

Smads 蛋白家族是BMP-7 信号转导通路中的重要胞浆递质，其中Smad1、Smad5 和Smad8 是胞内介导BMP 信号通路中重要的下游信号分子，在靶基因的转录中起着非常重要的作用。本实验结果表明，肾再灌注24 h 后，p-Smad1/5/8 表达水平明显低于sham 组，而IPostC 组p-Smad1/5/8 蛋白的表达量高于IR 组，这与BMP-7 变化趋势基本相一致。因此可以推测肾IPostC 的保护作用很可能与激活BMP-7/Smads 信号通路有关。

细胞凋亡是机体在受到生理和病理性刺激后，由基因控制的细胞自主有序的死亡。研究表明，肾小管上皮细胞的凋亡贯穿于急性肾IRI 修复整个过程，是肾小管上皮细胞死亡的最主要形式[9]。本实验采用TUNEL 染色检测细胞凋亡水平，结果显示，IR 组12h、24 h 时间点肾小管上皮细胞凋亡较多，AI 明显高于sham 组；与IR 组对应时间点相比，IPostC 组肾小管上皮细胞的凋亡明显减少，AI 较低。诸此表明，肾IPostC 可通过抑制肾小管上皮细胞凋亡来减轻肾IRI。此外，还对凋亡指数AI 和p-Smad1/5/8 蛋白表达水平作了相关性分析，结果显示，两者间存在显著的负相关性，提示Smad 蛋白信号转导可引起肾小管上皮细胞凋亡的变化。至于p-Smad1/5/8 蛋白是如何抑制肾小管上皮细胞的凋亡，尚需深入研究。

综上所述，本研究证实了肾IPostC 能够上调肾组织BMP-7 的表达，下调BMP-7 内源性拮抗剂USAG-1 的表达，进而通过激活BMP-7/Smad1/5/8信号通路来抑制肾小管上皮细胞凋亡，从而产生机体的内源性保护作用。