HPLC 法同时测定氢溴酸右美沙芬糖浆中主药和降解杂质及防腐剂的含量

连云港市食品药品检验检测中心，连云港 222006

氢溴酸右美沙芬糖浆为中枢性镇咳药，可抑制延脑咳嗽中枢而产生镇咳作用，长期服用无成瘾性和耐受性。该药现行质量标准为国家药品标准WS1-（X-341）-2003Z，收载于《国家食品药品监督管理局国家药品标准新药转正标准》（第45 册）[1]，该标准中只有主成分氢溴酸右美沙芬的含量测定，并未对杂质和防腐剂进行质量控制。《中国药典》2015 年版四部规定糖浆剂中含蔗糖量应不低于45%[2]，因此本品中含有高浓度的蔗糖，极易产生糖的降解杂质5-羟甲基糠醛（5-HMF）。5-HMF 属于2 类遗传毒性杂质，具有致突变性、致敏性和遗传毒性等多种毒副作用[3-7]。目前遗传毒性杂质已成为药品监管机构、制药企业和医疗机构关注的焦点[8]。氢溴酸右美沙芬糖浆处方中还含有防腐剂苯甲酸或羟苯乙酯，防腐剂虽能够抑制微生物在糖浆剂中生长和繁殖，但过量摄入对人体也会有一定的毒性[9-11]，尤其是儿童用药，如苯甲酸会损害神经系统、具有细胞毒性和致癌等。羟苯酯类影响男性生殖系统和诱发女性乳腺癌等[9-11]，故有必要对氢溴酸右美沙芬糖浆中的降解杂质和防腐剂的含量进行质量控制。本研究建立HPLC 法同时测定氢溴酸右美沙芬糖浆中的氢溴酸右美沙芬、5-羟甲基糠醛、苯甲酸和羟苯乙酯的含量，有利于提高本制剂的质量控制标准。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

Waters 2695 高效液相色谱仪（含二极管阵列检测器，美国沃特世公司）；Waters Empower 色谱工作站；Sartorius BP211D 型电子分析天平（德国Sartorius 公司）；KH-700DE 型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

氢溴酸右美沙芬、5-羟甲基糠醛、苯甲酸、羟苯乙酯对照品（纯度分别为94.8%、99.2%、99.9%、99.9%，批号分别为100201-201204、111626-201912、100419-201703、100847-201604）均购自中国食品药品检定研究院；氢溴酸右美沙芬糖浆（厂家A，批号为190202、190602、190802、200103，规格0.15%；厂家B，批号为190205、190301、190411、190502，规格0.2%）；甲醇为色谱纯；磷酸二氢铵、磷酸为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1 mol·L-1磷酸二氢铵溶液（取磷酸二氢铵11.5 g，加磷酸1 mL，用水稀释至1000 mL）（B）；梯度洗脱（0～10 min，15%A；10～11 min，15%A→50%A；11～26 min，50%A；26～27 min，50%A→15%A；27～35 min，15%A）；检测波长：279 nm；柱温：30 ℃；体积流量：1.0 mL·min-1；进样体积：20 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取氢溴酸右美沙芬、5-羟甲基糠醛、苯甲酸、羟苯乙酯对照品适量，用甲醇-水（1∶1）溶解配制成1.4604、0.09715、1.3540、0.2924 mg·mL-1的混合对照品储备液；精密量取该储备液2 mL，置10 mL 量瓶中，甲醇-水（1∶1）定容至刻度，摇匀，制成每毫升分别含上述成分0.2921、0.01943、0.2708、0.05848 mg 的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密量取供试品5 mL，置25 mL 量瓶中，加甲醇-水（1∶1）适量，超声处理10 min，使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过即得。

2.2.3 阴性样品溶液 以溶剂甲醇-水（1∶1）作为阴性样品溶液。

2.3 专属性考察

取上述混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果见图1。

检测表明，5-羟甲基糠醛、苯甲酸、氢溴酸右美沙芬、羟苯乙酯均能达到基线分离，待测成分色谱峰的理论塔板数均大于3000，各成分之间无干扰，证明该方法专属性良好。

2.4 线性关系考察

精密量取混合对照品储备液0.2、0.5、1、2、4、6 mL，分别用甲醇-水（1∶1）定容于10 mL 量瓶中，摇匀，即得系列混合对照品溶液。按“2.1”项的色谱条件对上述系列混合对照品溶液进行测定，并绘制出横、纵坐标分别为质量浓度（μg·mL-1）和峰面积（Y）的标准曲线，得氢溴酸右美沙芬、5-羟甲基糠醛、苯甲酸和羟苯乙酯的回归方程及线性范围（n=6），分别为Y=6.6002×103X－2.2593×104（r=0.9998，29.21～876.2 μg·mL-1）；Y=1.3768×105X－3.2880×104（r=0.9997，1.94～58.29 μg·mL-1）；Y=7.3378 ×103X－1.8058×104（r=0.9998，27.08～812.4 μg·mL-1）；Y=3.2497×104X－2.3063×104（r=0.9997，5.85～175.4 μg·mL-1）。

2.5 进样精密度试验

取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，连续进样6 次，记录峰面积，结果氢溴酸右美沙芬、5-羟甲基糠醛、苯甲酸和羟苯乙酯峰面积的RSD 分别为0.32%、0.46%、0.26%、0.37%，表明仪器精密度良好。

图1 高效液相色谱图

2.6 稳定性试验

取已知含量的供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样分析，记录色谱图。结果氢溴酸右美沙芬、5-羟甲基糠醛、苯甲酸和羟苯乙酯峰面积的RSD 分别为0.84%、1.03%、0.76%、1.48%，表明稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批号的样品6 份，按“2.2.2”项下方法进行操作，结果厂家A（批号190802）中氢溴酸右美沙芬、5-羟甲基糠醛、苯甲酸的平均含量分别为1.41、0.10、1.34 mg·mL-1，RSD 为0.53%、0.86%、0.46%；厂家B（批号190502）氢溴酸右美沙芬、5-羟甲基糠醛、羟苯乙酯的平均含量分别为1.90、0.05、0.29 mg·mL-1，RSD 为0.77%、1.32%、1.09%，表明方法的重复性良好。

2.8 回收率试验

取同一批已知含量的供试品（批号190802）6份，每份1 mL，置10 mL 量瓶中，分别精密加入对照品储备液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件进样，分别测定其峰面积，按外标法计算回收率和RSD，结果见表1。

表1 回收率试验结果（n=6）

2.9 样品含量测定

取氢溴酸右美沙芬糖浆各批样品适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按外标法计算含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（mg·mL-1，n=3）

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

本研究考察甲醇-水、甲醇-磷酸二氢铵缓冲液系统作为流动相，分别进行等度、梯度洗脱，在等度洗脱条件下几种组分分离不理想且耗时较长；采用梯度洗脱时发现，5-HMF 极性大，在有机相比例较小时就很快出峰，而苯甲酸、氢溴酸右美沙芬、羟苯乙酯在有机相比例较高时才能较快出峰，为了缩短分析时间，在梯度程序的后半段调高了有机相比例。结果采用甲醇-磷酸二氢铵缓冲液系统并进行梯度洗脱，样品中各待测组分之间能够有效分离，且相邻成分不干扰测定。

3.2 溶剂与提取方法的选择

在试验中对比了不同的提取溶剂水、50%甲醇、70%甲醇、甲醇对各成分的提取效果，结果以50%甲醇作为提取溶剂时，样品中所测成分综合提取效果最佳；同时考察超声时间0、5、10、20 min 对提取效果的影响，结果发现超声10 min 即可提取完全。

3.3 测定波长的选择

试验采用DAD 检测器，在190～400 nm 的范围内对待测成分色谱峰进行全波长扫描，氢溴酸右美沙芬、5-羟甲基糠醛、苯甲酸和羟苯乙酯分别在279 nm、284 nm、273 nm、257 nm 处有最大吸收。根据四种成分的紫外光谱图进行分析，综合考虑，选择279 nm 波长较合适，在此波长条件下，四种组分均有较强响应值。

3.4 结果分析

实验收集了市售的2 个厂家共8 批氢溴酸右美沙芬糖浆，结果显示，同一厂家的防腐剂用量无明显差异。《中国药典》2015 年版四部通则中糖浆剂项下规定：苯甲酸用量不得过0.3%，羟苯酯类用量不得过0.05%[2]。试验测得的8 批样品中的防腐剂用量均在药典规定范围内。5-HMF 在8 批样品中均有检出，不同厂家不同批号之间5-HMF 含量有明显差异。厂家A 氢溴酸右美沙芬糖浆用量为一次20mL，一日3 次，则5-HMF 最大日暴露量为15.78 mg；厂家B 氢溴酸右美沙芬糖浆用量为一次15 mL，一日3 次，则5-HMF 最大日暴露量为2.25 mg，均远远高出了5-HMF 作为2 类遗传毒性杂质限度（TTC 为1.5 μg·d-1）的要求[3]。由于TTC 是高度保守的暴露量，限度制定也需根据生产工艺难度及用药周期等情况进行调整。文献[3]中报道，2015 年版药典中收载的5%、10%葡萄糖注射液及以葡萄糖注射液为载体的制剂的最大日暴露量分别为1.75 mg、3.5 mg 和5 mg，根据样品中5-HMF 检出情况，参考最大日暴露量5 mg 来制定本品的限度，经折算，厂家A（规格0.15%，每日最大用量60 mL）的限度为0.08 mg·mL-1，厂家B（规格0.2%，每日最大用量45 mL）的限度为0.11 mg·mL-1，结果，厂家B 4 批样品5-HMF 均在限度范围内，厂家A 有3 批样品超出限度，建议完善生产工艺，或兼顾安全性和质量风险两方面的因素，综合考虑制定合适的限值。防腐剂和遗传毒性杂质对人体的毒副作用越来越受到重视，有些厂家已经对口服液体制剂中的防腐剂或5-HMF 进行质量控制并订入质量标准中，本研究建立的方法简便、准确、专属性强，既提高了氢溴酸右美沙芬糖浆的质量控制，又简化了检验过程，为修订该品种质量标准提供参考依据。