大黄蛰虫丸对AOM/DSS 诱导结肠炎相关结直肠癌小鼠的抑制作用*

2021-03-06戴国梁杨欣怡陈闪闪许美娟居文政邹建东

药学与临床研究 2021年1期

戴国梁，杨欣怡，陈闪闪，许美娟，居文政，邹建东

南京中医药大学附属医院临床药理科，南京 210029

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，目前CRC 的发病率和死亡率分别位居恶性肿瘤的第4 位和第2 位。有研究显示，至2035 年，所有国家的结肠癌和直肠癌的死亡人数预计将分别上升60.0%和71.5%[1]。当前对CRC的研究大多集中在比传统疗法更简便、有效的新疗法上，新药开发及其临床实施可能对改善CRC 患者的整体生存率和生活质量起到积极作用。慢性炎症与CRC 的发生发展密切相关，“炎症-异常隐窝-腺瘤-癌症”是结肠炎相关结直肠癌（colitis-associated cancer，CAC）发生的基本路径[2]，炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）患者如得不到有效的治疗，其30 年内罹患CAC 的风险要比正常人高20 倍[3]，这提示炎症反应在CAC 发生发展中具有重要作用，控制“炎-癌转化”对防治CAC 意义重大。

从中药中筛选治疗CAC 的有效药物值得期待，大黄蛰虫丸（Dahuang Zhechong Pill，DZP）是《金匮要略》经典名方，由熟大黄、黄芩、甘草、桃仁、杏仁、芍药、干地黄、干漆、虻虫、水蛭、蛴螬及蛰虫12 味中药组成，是中医临床治疗肿瘤的最常用方剂之一。研究表明，DZP 配合化疗可以改善晚期胃癌症状，同时对胃肠道恶性肿瘤患者有益。

前期研究证实，大黄中的活性成分大黄素可以通过抑制血管内皮素受体2（VEGFR2）降低结肠癌HCT116 细胞的增殖和迁移[4]。此外，研究发现，桃仁与杏仁的提取物均能抑制结肠癌细胞的增殖[5]。黄芩中的活性成分黄芩苷可通过抑制c-Myc、下调SP1转录因子等多种机制诱导结肠癌细胞凋亡[6]。因此，DZP 可能是治疗结直肠癌的有效药物。在本研究中，拟使用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠（AOM/DSS）诱导的CAC 模型小鼠，探究DZP 对CAC 的影响及其治疗CAC 的作用机制。

1 材料

1.1 仪器

MicroCL17R 高速低温离心机（赛默飞世尔科技公司）；DMI3000B 光学显微镜（莱卡公司）；Axio Observer Z1 荧光显微镜（蔡司公司）；ELx800 酶标仪、Mini Protean 电泳仪、转印槽及电泳电源、Gel-Doc XR 凝胶成像系统（均伯腾仪器有限公司）。

1.2 药物与试剂

大黄蛰虫丸（规格：3 g/丸，批号：17013622，北京同仁堂制药厂）；偶氮甲烷（AOM，批号：SLBV4860，规格：25 mg/瓶，Sigma 公司）；双琥珀酰亚胺辛二酸酯（DSS，批号：160110，规格：500 g/瓶，MP biomedicals 公司）；小鼠IL-1β ELISA 检测试剂盒（批号：ab197742）、小鼠IL-18 ELISA 检测试剂盒（批号：ab216165）、兔紧密连接相关蛋白Occludin 单克隆抗体（批号：ab216327）、兔闭锁小带蛋白（zonula occludens-1，ZO-1）单克隆抗体（批号：ab221547）、兔IL-1β 单克隆抗体（批号：ab234437）、兔IL-18 单克隆抗体（批号：ab71495）、兔自噬相关蛋白LC3B 单克隆抗体（批号：ab192890）、兔Sequestosome 1（SQSTM1）单克隆抗体（批号：ab109012）、兔自噬相关蛋白5 同源物（ATG5）单克隆抗体（批号：ab109490），均购自Abcam 公司；兔甘油酸-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体（批号：10494-1-AP）、辣根过氧化物（HRP）-山羊抗兔IGg（批号：SA00001-2）及FITC-山羊抗兔IGg（SA00003-2）均购自Proteintech 公司；3，3'-二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（批号：P0203）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液（批号：C1006）、苏木精-伊红（HE）染色液（批号：C0105M）及超敏ECL 化学发光试剂盒（批号：P0018M），均购自碧云天生物技术公司；其他试剂为分析纯；去离子水。

1.3 动物

60 只SPF 级C57BL/6 雄性小鼠，12 周，18～22g，购自北京华阜康生物科技公司。实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0008，饲养于南京中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK（苏）2018-0049。

2 方法

2.1 CAC 模型小鼠的复制、分组与给药

60 只SPF 级C57BL/6 雄性小鼠，适应性饲养后，随机分为4 组：对照组、模型组、DZP 低剂量组（2 g·kg-1）、DZP 高剂量组（4 g·kg-1）；每组15 只。除对照组外，其余各组小鼠，给予单次10 mg·kg-1AOM 腹腔注射，1 周后联合3 个循环DSS 喂饲（2%DSS 饮水1 周+正常饮水2 周为一个循环），建立AOM/DSS 诱导的CAC 模型小鼠。对照组同步腹腔注射等体积生理盐水并正常饮水。第1 个DSS 喂饲循环结束后（开始造模2 周后），开始灌胃给予相应药物，对照组和模型组小鼠灌胃等体积生理盐水，周期为8 周。在实验周期中，记录小鼠生存情况，并绘制各组小鼠的生存曲线，实验周期结束后，取小鼠血液和结肠组织进行相应检测。

2.2 ELISA

使用ELISA 试剂盒检测小鼠血液中IL-1β 及IL-18 的水平。参阅此两种试剂盒说明书，对标准品进行梯度稀释以绘制标准曲线。将不同组的小鼠血清分别加入包被了抗IL-1β 或IL-18 抗体的96 孔板中，同时加入的还有不同浓度的对应试剂盒的标准品。反应30 min 后加入显色底物，之后加入反应终止液。清洗后，将96 孔板置于酶标仪中，450 nm波长处检测吸光度值，根据IL-1β 及IL-18 的标准曲线，计算各小鼠血清中IL-1β 及IL-18 的水平。

2.3 HE 染色

各组小鼠结肠固定于10%福尔马林，垂直切取一段放于一次性包埋框。以不同浓度乙醇进行脱水。之后将各组小鼠结肠浸泡于二甲苯中20min。融化的石蜡浸泡结肠40min 后，更换石蜡，再次浸泡40min。将小鼠结肠包埋成蜡块，小鼠结肠的横截面朝下。使用切片机将含有小鼠结肠的蜡块切成5 μm 的蜡片，获得小鼠结肠切片。将小鼠结肠切片放入二甲苯中溶解石蜡，再使用从高到低浓度的乙醇进行浸泡，最后将小鼠结肠切片置于去离子水中。

使用苏木素染色液对小鼠结肠切片进行染色，使用盐酸-乙醇溶液分化后，常水冲洗20 min 返蓝。在使用伊红染色液染色后，对小鼠结肠切片进行快速脱水并封片。封片后，使用普通光学显微镜对小鼠结肠组织进行拍照，对其进行组织学评分，评分标准为由轻到重以0～5 分评判（5 分=显著性增加，3分=中度增加，1 分=轻度增加，0 分=正常）。根据以下参数进行评判：隐窝萎缩（隐窝个数，隐窝底部与黏膜肌距离）；隐窝多形核白细胞浸润量、单核细胞浸润量；隐窝基底部及黏膜基层淋巴细胞。

2.4 免疫组织化学染色

同HE 染色中的步骤，获得复水的小鼠结肠组织切片。之后使用3%的H2O2溶液孵育小鼠结肠组织以阻断内源性过氧化物酶。PBS 缓冲液清洗小鼠结肠组织后，使用柠檬酸盐缓冲液在95 ℃的水浴锅中孵育小鼠结肠组织20 min，以修复小鼠结肠组织中的抗原。正常山羊血清孵育小鼠结肠组织20 min，将ATG5、IL-1β 和IL-18 抗体稀释100 倍，4 ℃孵育小鼠结肠组织过夜。用稀释后的HRP-山羊抗兔IGg（1∶200）在室温孵育小鼠结肠组织2 h。PBS 清洗后，DAB 显色液孵育组织以显色。PBS 再次清洗后，使用苏木素复染细胞核。将小鼠结肠脱水、透明后封片，置于光学显微镜下观察并拍照。

2.5 免疫组织荧光染色

同HE 染色中的步骤，获得复水的小鼠结肠组织切片。之后使用柠檬酸盐缓冲液在95 ℃的水浴锅中孵育小鼠结肠组织20 min，以修复小鼠结肠组织中的抗原。正常山羊血清孵育小鼠结肠组织20 min，将Occludin 和ZO-1 抗体稀释100 倍，4 ℃孵育小鼠结肠组织过夜。用稀释后的FITC-山羊抗兔IGg（1∶200）在室温下孵育小鼠结肠组织2 h。PBS 清洗后，DAPI 染色液孵育小鼠结肠切片5 min，PBS 再次清洗后，甘油封片，置于荧光显微镜下观察并拍照。

2.6 蛋白印迹

取小鼠结肠组织，按照其每100 mg 加入1 mL裂解液的比例，置于EP 管中。用均质仪打碎组织，4 ℃裂解30 min，12000 r·min-1离心10 min 后取上清液，检测小鼠结肠组织的蛋白浓度。制备蛋白印迹实验样品和SDS-PAGE 凝胶，各孔加样量为50μg。电泳分离蛋白后，进行转膜操作。使用稀释后的LC3B（1∶1000）、SQSTM1（1∶1000）及ATG5（1∶1000）抗体孵育PVDF 膜过夜。清洗后，使用稀释后的HRP-山羊抗兔IGg（1∶10000）孵育PVDF 膜2 h。再次清洗后，使用凝胶成像系统对蛋白印迹进行显影，存储图片。

2.7 统计分析

免疫组织化学染色和免疫组织荧光染色的图片应用Image pro plus（美国，Media Cybernetics）软件进行计算平均光密度，并导出计量数据。蛋白印迹图片使用Image Lab（美国，Bio-Rad）软件进行相对定量分析，并导出计量数据。所有数据以均数±标准差（）表示，数据结果采用Graph Pad Prism7软件进行方差分析和作图。多组间的比较采用单因素方差分析。P<0.05 为具有统计学意义。

3 结果

3.1 DZP 降低CAC 模型小鼠的死亡率和血清中炎症因子的水平

与对照组相比，模型组生存率显著降低，15 只小鼠存活9 只（P<0.01）。给药后DZP 显著降低了模型小鼠的死亡率，其中DZP 低剂量组存活12 只、高剂量组小鼠存活14 只（P<0.05），见图1A。CAC 模型小鼠血清IL-1β 和IL-18 水平显著升高（P<0.01），经DZP 治疗8 周后，显著降低了CAC 模型小鼠血清IL-1β 和IL-18 水平（P<0.01）。见图1B-C。

图1 DZP 对CAC 模型小鼠的死亡率和血清炎症因子水平的影响（）

3.2 DZP 改善CAC 模型小鼠的肠道炎症和病理组织学

小鼠结肠组织免疫组织化学染色结果显示，与对照组相比，模型组小鼠结肠中IL-1β 和IL-18 水平显著增加（P<0.01），经DZP 治疗8 周后，显著降低了CAC 模型小鼠结肠组织中IL-1β 和IL-18 的表达水平（P<0.01），见图2A-D。HE 染色结果显示，CAC 模型小鼠结肠炎细胞浸润严重，DZP 治疗后可显著减轻CAC 模型小鼠结肠内的炎症。对结肠HE染色进行组织学评分结果显示，DZP 可改善CAC 模型小鼠结肠的病理组织学（P＜0.01）。见图2E-F。

3.3 DZP 改善CAC 模型小鼠结肠紧密连接

免疫组织荧光染色结果显示，与对照组相比，CAC 模型小鼠结肠中紧密连接相关蛋白Occludin及ZO-1 的表达显著降低（P<0.01），经DZP 治疗8周后，显著增加了CAC 模型小鼠结肠中Occludin及ZO-1 蛋白的表达（P<0.05，P<0.01）。见图3A-D。

3.4 DZP 促进CAC 模型小鼠结肠自噬

小鼠结肠组织免疫组织化学染色结果显示，与对照组相比，CAC 模型小鼠结肠中ATG5 水平显著降低（P<0.01），经DZP 治疗8 周后，显著增加了CAC 模型小鼠结肠组织中ATG5 的表达水平（P<0.01），见图4A-B。蛋白印迹结果显示，与对照组相比，模型组小鼠结肠中SQSTM1 蛋白表达水平显著增加（P<0.01），LC3BⅠ/Ⅱ及ATG5 的蛋白表达水平显著降低。经DZP 治疗8 周后，显著降低CAC 模型小鼠结肠组织中SQSTM1 的蛋白表达水平（P<0.01），并显著上调CAC 模型小鼠结肠组织中LC3BⅠ/Ⅱ及ATG5 的蛋白表达水平。见图4C-F。

图2 DZP 对CAC 模型小鼠结肠炎症及病理组织学的影响（，n=8）

4 讨论

药理实验表明，结合AOM 及DSS 可诱导CAC的两步式肿瘤模型，是研究CAC 发病机理的经典模型。肿瘤的进展不仅取决于其内在因素，而且受到多方面的全身过程的影响，尤其是全身性的炎症。在某些类型的肿瘤中，发生恶性变化之前就存在炎症，致癌性变化又会诱发炎症微环境，从而促进肿瘤的发展。炎症促进肿瘤的作用已被证实，包括促进恶性肿瘤细胞的增殖和存活，促进血管生成和转移[7]。本实验结果表明，DZP 可显著降低CAC 模型小鼠的死亡率及血清中IL-1β 和IL-18 的水平。

肠道慢性炎症导致其上皮细胞因子和趋化因子诱导的增加，被认为是导致CAC 及CRC 重要因素[8]，随之而来的变化是肠道上皮细胞增殖、存活和迁移的改变[9]。有研究表明，发炎的结肠黏膜在没有发生任何组织学改变之前，其分子信号经历了与癌症相似的变化[10]。此外，临床研究显示，大肠腺瘤的患病率与患者血液中较高的IL-6 和TNF-α 浓度有关，系统性炎症可能与大肠肿瘤的早期发展有关[11]。因此，抑制肠道炎症可能是延缓或治疗CAC 及CRC 的有效策略。本实验表明，DZP 可有效抑制CAC 模型小鼠的肠道炎症，这可能是其减轻CAC模型小鼠全身炎症并降低小鼠死亡率的原因之一。

研究表明，肠道炎症的增加导致肠道屏障的破坏，也是导致全身性炎症的直接原因。正如实验观察到的、CAC 模型小鼠结肠中的紧密连接相关蛋白Occludin 及ZO-1 的表达显著降低，这可能促进了小鼠肠道炎症和CAC 的发生。在CRC 中，自噬被认为具有促进肿瘤和抑制肿瘤的双重作用[12]，但潜在机制仍不清楚。慢性炎症会干扰自噬机制的正常运作，在上皮细胞中，自噬缺陷可以通过增强氧化应激和基因组不稳定性，以及激活转录因子来促进肿瘤的发生[13]。一项临床研究发现，CRC 患者肠道组织中ATG5 下调[14]，此结果与本实验结果一致。同时，SQSTM1 在CAC 模型小鼠结肠中的表达增加，而LC3B 的表达减少。经DZP 治疗8 周后，模型小鼠结肠LC3BⅠ/Ⅱ及ATG5 的表达增加，而SQSTM1 的表达降低。上述实验结果表明，DZP 增强了CAC 模型小鼠结肠的自噬水平，DZP 治疗CAC 作用与其促进结肠自噬有关。