基于UPLC-Q-TOF-MS 技术的阿司匹林抵抗血清代谢组学研究*

蒋志涛，吕玲燕，韩 怡，倪 磊

南京中医药大学附属张家港医院药学部，张家港 215600

阿司匹林抗血小板功效显著，常用于心血管疾病（cardiovascular disease，CVDs）的一级和二级预防。从20 世纪90 年代以来，临床上出现有部分患者使用阿司匹林后并没有达到预期治疗效果，称之为“阿司匹林抵抗”（aspirin resistance，AR）[1]。鉴于阿司匹林是改善患者CVD 结局干预措施的关键物质，有发生CVD 事件风险的患者如果出现AR 就是重要的临床问题。同时AR 患者的心血管事件发生率和死亡率显著增加，Gum PA 等[2]研究了326 例使用阿司匹林的稳定性CVD 患者，其中有17 例（5.2%）出现AR，平均随访1.9 年后，AR 患者的复合终点（死亡、心肌梗死或脑卒中）发生率为24%，显著高于其余患者的10%。目前尚不完全清楚AR产生的机制，研究显示，其主要的影响因素包括用药依从性差、阿司匹林药代动力学变化、与其他药物相互作用、血小板活性上调、非血小板COX-1 来源的血栓素A2 生成增多、药物治疗靶点变化等[3]。

现有的AR 治疗措施主要为调整药物剂量、服药时间、控制基础疾病等，临床效果并不显著。中医药干预AR 治疗具有独特的优势。马卫琴等[4]研究了87 例AR 患者的体质类型，其中以血瘀、气虚体质较为常见。陈光等[5]研究多项中医药临床干预AR，结果显示血瘀既是AR 的病因，也是AR 的病理产物，血瘀证与AR 紧密相关。还有研究表明，AR 最终将导致血瘀证的出现[6]。本研究运用超高效液相色谱-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术寻找AR相关的潜在生物标志物，为后期深入探讨“药物改善AR 的作用机理”打下基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ACQUITY UPLC TM 型超高效液相色谱仪和Xevo G2-XS 型飞行时间质谱（美国Waters 公司）；AE240 电子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）。

1.2 药物与试剂

阿司匹林肠溶片（拜阿司匹林，批号BJ40031，拜耳医药保健公司）；布洛芬缓释胶囊（芬必得，批号18010587，中美天津史克公司）；硫糖铝咀嚼片（批号227004，重庆科瑞制药）；乙腈、甲酸、甲醇为色谱纯；醋酸铵为分析纯；超纯水。

1.3 动物

雄性金黄地鼠（SPF 级）80 只，6～8 周龄，体重120～140 g，购于南京青龙山动物养殖场，动物许可证号：SCXK（苏）2017-0001。

2 方法与结果

2.1 金黄地鼠分组及AR 模型建立

参考唐世英等[7]金黄地鼠高脂血症动物模型研究，将金黄地鼠随机分为空白组（A 组，n=12）、阿司匹林抵抗模型组（B 组，n=12）。A 组自由餐食饮水；B 组给予饲料（高脂高盐高糖）喂养12 周。具体造模方式为：第9 周开始每天早上8 时给予B 组金黄地鼠硫糖铝（14.8 g·kg-1）灌胃一次，下午1 点给予B 组阿司匹林（0.74 g·kg-1）和布洛芬（2.22 g·kg-1）混合灌胃一次，药物剂量随金黄地鼠体重变化而每1 周调整一次。同时第9 周开始每天下午4 时将B 组金黄地鼠置于10 m2密闭实验室内，点燃香烟15 支，持续30 min。

模型判断标准：B 组金黄地鼠第12 周禁食12 h后，于腹主动脉取血进行检测，检测结果：甘油三酯＞0.8 mmol·L-1、血清总胆固醇＞1.6 mmol·L-1，表明高脂血症模型成功。该金黄地鼠再进行血小板聚集检测[8]，其中血小板平均聚集率既符合腺苷二磷酸钠盐诱导下≥70%，又符合花生四烯酸诱导下≥20%，则认为其属于AR 造模成功。

2.2 血清样本采集与处理

采用腹主动脉取血法。为了减少采血对金黄地鼠体内内源性物质的干扰，采集空腹血样进行代谢组学分析。采血方法为：第12 周末，将所有金黄地鼠禁食12 h，10%水合氯醛（3 mL·kg-1）腹腔麻醉，仰卧位固定，开腹主动脉取血4 mL，以2 mL 全血供血小板聚集检测，2 mL 置于医用血清管中，3000 r·min-1离心20 min，取上层血清于-70 ℃保存，供UPLC-Q-TOF-MS 分析。

分析前于室温下解冻血清，涡旋30 s，取200 μL 样品加入1.5 mL EP 管中，而后加入800 μL 预冷的甲醇（4 ℃），涡旋30 s 后，4 ℃下12000 r·min-1离心10 min，吸取上清液，放置于离心浓缩仪35 ℃离心挥干，50%甲醇100 μL 复溶，4 ℃下12000 r·min-1离心10 min，吸取50 μL 于进样小瓶中待测。

为保证分析系统的稳定性，采用质量控制（quality control，QC）样品进行方法验证。QC 样品是由每个样品各取40 μL 复溶液混合而得，为降低误差，样品检测为随机进行。在对样品分析前，先运行5 次QC 样品以平衡系统，在检测过程中，每检测5个样品后运行1 次QC 样品，以衡量系统的稳定性。

2.3 色谱条件

采用Acquity UPLCTM BEH C18色谱柱（2.1mm×50 mm，1.7 μm）；柱温：40℃；流速：0.4 mL·min-1，采用梯度洗脱的方式运行15 min。每次进样5μL，自动进样器温度设定4℃。正离子检测：A 流动相=99.9%乙腈、0.1%甲酸；B 流动相=99.9%水、0.1%甲酸。负离子检测：A 流动相=90%乙腈、10%水，10 mmol 醋酸铵，氨水调节pH 至9；B 流动相=5%乙腈、95%水，10 mmol 醋酸铵，氨水调节pH 至9。洗脱程序：0～0.5 min，3% B；0.5～1.5 min，3～20% B；1.5～6 min，20～60% B；6～9 min，60～95% B；9～12 min，95% B；12～12.1 min，95～3% B；12.1～15 min，3% B。

2.4 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）采用正、负离子扫描模式，毛细管电压3.0kV，锥孔电压30V，碰撞能电压6eV，离子源温度120 ℃，除溶剂温度350 ℃，除溶剂气体流为700 L·h-1氮气，采集范围m/z 100～1000，碰撞气体为氦气。

质谱正离子扫描，全扫描范围m/z 70～1050。全扫描中选择离子强度TOP15 的母离子进行二级质谱鉴定。质谱负离子扫描，全扫描范围m/z 70～1050。全扫描中选择离子强度TOP15 的母离子进行二级质谱鉴定。

2.5 系统稳定性检测

运用UPLC-Q-TOF-MS 代谢组学研究，稳定的实验方法才能获得可靠的实验数据。每隔4 个样品分析QC 样品和空白样品，以检验分析方法的稳定性和色谱上样量。

2.6 数据处理和统计分析

获取UPLC-Q-TOF-MS 指纹图谱后，采用Analyst®TF 1.7 Software 导出原始数据，可以存储到与每份样品对应的独立的文件中，PeakView 将异常的峰去掉；Markview 进行峰对齐。最终获得包含质荷比、保留时间和峰面积三维数据表，利用QC 样品对所有峰进行校正，将校正后的数据导入Simca-P v13.0 和EZinfo 3.0 进行多维统计分析，以便筛选出变量。采用主成分分析（PCA）得分图，直观地表示组与组之间的差异，通过偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）的变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值，筛选前后变化显著的差异代谢物，使用SPSS 16.0 软件进行统计学处理，两组间差异显著性比较采用t 检验，P<0.05 表示差异有统计学意义。将找到的潜在差异代谢物在HMDB（human metabolome databatabase）、METLIN 和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库进行检索与确认，得到最终匹配差异代谢物。

2.7 主成分分析

在正、负离子模式下，血清及QC 样品PCA 得分图见图1。将经过校正后的质谱数据，采用PCA法研究阿司匹林抵抗血清代谢物谱图模式变化，获得三组血清样本在空间上的分布情况。图1 同一颜色代表相同症状研究组，相同颜色越集中说明同一症状个体差异小，越分散表明个体差异大。PCA 结果表明，正、负离子模式下，QC 样品的聚集状况均良好，表明系统的稳定性良好。AR 组和对照组尽管有部分交叉重叠，但有一定的分离趋势。

图1 血清及QC 样品正（A）、负（B）离子模式下的主成分分析得分图

2.8 偏最小二乘法及置换检验

为消除与研究目的无关的随机误差及组内误差，对UPLC-Q-TOF-MS 数据采用有监督的PLS-DA方法再次进行分析。PLS-DA 由PCA 演变而来的双线性回归模型，能够忽略次要因素对结果的不利影响，提高判别分析的能力，有助于确定两组间的差异成分，从而识别有效的标志物，不同颜色符号在此种建模中分散的越开，说明两组间的成分差异越显著。本研究PLS-DA 得分图见图2，其显示AR 组与对照组分离明显，说明两组间存在一定差异。PLS-DA 正、负离子模式的模型参数分别为R2Y=0.929，Q2=0.435；R2Y=0.978，Q2=0.673；表明模型有效。进一步对模型进行响应置换检验，100 次随机改变后建立对应数据的PLS-DA 模型，以获取模型的R2和Q2值。在两种模式下，R2=0.932，Q2=0.201；R2=0.954，Q2=0.137；说明建立的模型符合样本数据的真实情况，不存在过拟合现象，模型稳健性良好。

2.9 差异代谢物的筛选[9]

本研究使用PLS-DA 模型中VIP 值参数，结合t 检验进行组间比较，筛选潜在的差异代谢物，VIP值是两组中含量显著改变的代谢物值，VIP 值＞1 并P＜0.05 时，显示对应的代谢物是差异性代谢物。针对组间的比对情况，在金黄地鼠不同组血清样本中找到主要差异性代谢物，其中倍数变化（fold change，FC）代表不同组血清代谢物含量的比值，FC≥1.5 表明不同组血清中该代谢物质相比正常组含量上升，表达为上调代谢物，FC≤2/3 表明不同组血清中该代谢物质含量下降，表达为下调代谢物。通过搜索ChemSpide、MassBank、MetFrag 和Metlin等数据库，结合质谱数据鉴定差异代谢物。结果表明与对照组相比，AR 组有脱氧胆酸、硬脂酸、松香酸、谷氨酰胺、肌酸等11 个特异性代谢分子，其信息见表1。代谢物通路分析提示，与脂肪酸生物合成、二次胆汁酸生物合成、氨基酸代谢等密切相关。

图2 对照组和AR 组正、负离子模式下最小二乘法判别分析

表1 主要差异代谢物信息

3 讨论

AR 的病理生理过程十分复杂，目前其机制尚未阐明。代谢组学技术的应用，为从代谢的视角揭示AR 病理生理学过程的变化，以及它们包含的生物学意义提供了新的工具和方法。本实验采用UPLC-Q-TOF-MS 技术比较了AR 大鼠与正常大鼠血清化学成分的变化。模型组大鼠血清中含有各类小分子代谢物，包括氨基酸、脂肪酸、胆汁酸等，且部分在含量上与对照组有明显差异，这些物质参与了多种生理生化过程，特别是脂代谢和胆汁酸代谢。

脱氧胆酸是胆酸失去一个氧原子衍生而得的一种游离胆汁酸，胆汁酸促进脂类物质的消化与吸收，是体内胆固醇的主要代谢去路，胆固醇转化为胆汁酸的代谢途径异常可导致高胆固醇血症，进而参与动脉粥样硬化的发生、发展。临床研究证明，胆汁酸与血脂代谢紊乱、冠心病及脑血管疾病关系密切，有可能是冠心病的独立危险因素[10]。

心肌在正常状态下，脂肪酸氧化是其能量代谢的主要形式，心肌缺血缺氧时，脂肪酸代谢异常，表现为脂肪酸氧化减弱，中间产物堆积，心肌内血清游离脂肪酸水平升高，其中硬脂酸是长链脂肪酸氧化的中间产物。模型组样本中硬脂酸含量升高，提示AR 导致脂肪酸氧化速率下降，心肌能量代谢异常。

目前中医药干预AR 的研究主要集中于临床研究，一些单味中药（银杏、丹参、三七等）及中成药（复方丹参滴丸、通心络胶囊、护心胶囊等）均报道对预防及治疗AR 效果显著，但机制研究较少。范英华等[11]研究发现，丹酚酸A 可有效抑制多种诱导剂（ADP、花生四烯酸等）诱导的大鼠血小板聚集，并能显著升高血小板中cAMP 的含量，其机制与cAMP多条GPCRs 信号通路有关。赖润民等[12]通过网络药理学研究发现，丹红注射液改善AR 机制涉及凝血过程、炎症反应、代谢调节的21 条通路。

本研究显示，AR 组有11 个差异代谢物：脱氧胆酸、硬脂酸、松香酸、谷氨酰胺、肌酸等，为AR 的潜在生物标志物，提示AR 致病机理可能与脂肪酸生物合成、二次胆汁酸生物合成、氨基酸代谢有关，这为今后深入探讨中药改善AR 的作用机理提供理论数据。