吴茱萸碱对人肺癌NCI-H1299细胞抗肿瘤作用及其机制

雷天翔 刘震超 徐慧军 刘光 刘丽平 葛科立

［收稿日期］2022-03-17;  ［修訂日期］2023-10-07

［基金项目］山东省重点研发计划项目（2017GSF218084）

［第一作者］雷天翔（1986-），男，硕士研究生。

［通信作者］葛科立（1984-），男，博士，讲师。E-mail：472-733278@qq.com。

［摘要］  目的

探讨吴茱萸碱（EVO）在人肺癌NCI-H1299细胞中的抗肿瘤作用及其可能机制。

方法  应用CCK-8法检测EVO（1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 μmol/L）处理24、48、72 h对NCI-H1299细胞活力的影响，采用PI单染流式法和Annexin V-FITC+PI双染流式法分别检测EVO对NCI-H1299细胞周期和细胞凋亡的影响，Western blot法检测相关蛋白表达。

结果  与二甲基亚砜（DMSO）对照组相比，EVO能显著抑制NCI-H1299细胞的增殖活性，细胞增殖活力随着EVO浓度增加呈下降趋势，不同给药浓度组间比较差异有显著性（F=5 091.83，P＜0.01），不同时间点间比较差异有显著性（F=1 241.80，P＜0.01），且细胞增殖活力变化呈浓度和时间依赖性。12.5 μmol/L EVO处理细胞24 h后，与DMSO对照组相比，NCI-H1299被阻滞于G2/M期，NCI-H1299细胞凋亡率显著上升（t=35.52，P＜0.001），细胞周期相关蛋白Cdc2磷酸化水平及P53、CyclinB1、Cdc25C（间期）蛋白水平明显上升（F=13.55～69.14，P＜0.05），细胞凋亡相关蛋白胱天蛋白酶-3（caspase-3）、胱天蛋白酶-9（caspase-9）和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP1）表达增高（F=21.62～196.54，P＜0.05），B细胞淋巴瘤因子-2（Bcl-2）/Bcl-2相关X蛋白（Bax）比值明显降低（F=3.86，P＜0.05），受体相互作用蛋白1（RIP1）、受体相互作用蛋白3（RIP3）和混合系激酶区域样蛋白（MLKL）磷酸化水平明显上升，差异均有统计学意义（F=71.69～118.33，P＜0.05）。

结论

EVO可在NCI-H1299细胞中诱导细胞增殖抑制、G2/M细胞周期阻滞、内源性凋亡和程序性坏死，从而发挥抗肿瘤作用。

［关键词］  吴茱萸碱；肺肿瘤；细胞增殖；细胞周期；细胞凋亡；坏死性凋亡

［中图分类号］  R284;R734.2

［文献标志码］  A

［文章编号］  2096-5532（2024）01-0057-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.002

［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］  https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240227.0938.001;2024-02-28  14：43：38

Antitumor effect of evodiamine on human lung cancer NCI-H1299 cells and its mechanism

＼ LEI Tianxiang， LIU Zhenchao， XU Huijun， LIU Guang， LIU Liping， GE Keli

＼ （Institute of Integrative Medicine， Qingdao University Medical College，  Qingdao 266023， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the antitumor effect of evodiamine （EVO） on human lung cancer NCI-H1299 cells and its possible mechanism.

＼ Methods＼ CCK-8 assay was used to observe the effect of EVO （1.0， 2.5， 5.0， 7.5， 10.0， 12.5， and 15.0 μmol/L） on the viability of NCI-H1299 cells after 24， 48， and 72 h of treatment; PI staining and Annexin V-FITC+PI double staining were used to observe the effect of EVO on the cell cycle and apoptosis of NCI-H1299 cells; Western blot was used to mea-

sure the expression of proteins.

＼ Results＼ Compared with the dimethyl sulfoxide （DMSO） control group， EVO significantly inhi-

bited the proliferative activity of NCI-H1299 cells， and cell proliferative activity tended to decrease with the increase in EVO concentration; there was a significant difference between different concentration groups （F=5 091.83，P<0.01） and between different time points （F=1 241.80，P<0.01）， and cell proliferative activity changed in a concentration- and time-dependent manner. After the cells were treated with 12.5 μmol/L EVO for 24 h， NCI-H1299 cells were arrested in G2/M phase compared with the DMSO control group， and there were significant increases in the apoptosis rate of NCI-H1299 cells （t=35.52，P<0.001）， the phosphory-

lation level of the cell cycle-related protein Cdc2， and the levels of P53， CyclinB1， and Cdc25C （mitotic phase） proteins （F=13.55-69.14，P<0.05）. There were also significant increases in the expression levels of the cell apoptosis-related proteins caspase-3， caspase-9， and PARP1 （F=21.62-196.54，P<0.05）， a significant reduction in B-cell lymphoma factor-2/Bcl-2-associated X-protein ratio （F=3.86，P<0.05）， and significant increases in the phosphorylation level of receptor-interacting protein 1， receptor-interacting protein 3， and mixed-lineage kinase domain-like protein （F=71.69-118.33，P<0.05）.

＼ Conclusion＼ EVO can induce the inhibition of cell proliferation， G2/M cell cycle arrest， endogenous apoptosis， and programmed death of NCI-H1299 cells， thereby exerting an antitumor effect.

［Key words］＼ evodiamine; lung neoplasms; cell proliferation; cell cycle; apoptosis; necroptosis

非小细胞肺癌（NSCLC）是一种致死率很高的恶性肿瘤［1］，在肺癌的组织学类型中占比最高（约85%）［2］。近年来的临床研究显示，NSCLC发病率和病死率均呈上升趋势，其治疗主要以手术治疗、放化疗为主，但仍存在高复发、转移和耐药等问题预示了病人预后极差。迄今为止，肺癌发生发展的分子机制尚未完全明确。因此，更好地了解有关肺癌发生发展机制将有助于指导临床治疗［3］。中草药具有增效减毒、稳定瘤体、抑制复发和转移的作用。从中药中提取的活性抗肿瘤成分具有多靶点治疗的优势，逐步引起人们的重视［4］。吴茱萸碱（EVO）是从吴茱萸果实中提取的一种有效成分，具有抗肿瘤作用［5-6］。本研究旨在探讨EVO在人肺癌细胞NCI-H1299中的抗肿瘤作用及其可能的作用机制。

1  材料和方法

1.1  实验材料

1.1.1  细胞系  人肺腺癌细胞NCI-H1299购置于国家细胞资源中心。将NCI-H1299细胞放置于37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱内，用含体积分数0.10胎牛血清的DMEM/High Glucose培养液培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.1.2  抗体与试剂  EVO购自Selleck，用二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为40 μmol/L的储存液，－80 ℃储存。DMEM/High Glucose培养液（HyClone）；胎牛血清；磷酸盐缓冲液（PBS，HyClone）；2.5 g/L胰蛋白酶（Gbico）；DMSO、Cell Counting kit（CCK-8）试剂盒、碘化丙啶（PI）试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒（上海翊圣公司）。兔抗鼠一抗Cdc2、磷酸化Cdc2（p-Cdc2）、Cdc25C、CyclinB1、胱天蛋白酶-3（caspase-3）、胱天蛋白酶-9（caspase-9）、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP1）、受体相互作用蛋白1（RIP1）、受体相互作用蛋白3（RIP3）、p-RIP1、p-RIP3、P53、β-actin（CST）；山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗（Affinity）。

1.2  實验方法

1.2.1  CCK-8法检测NCI-H1299细胞增殖  取对数生长期的NCI-H1299细胞，用2.5 g/L胰酶消化，制成单细胞悬液，以每孔2×103个接种于96孔板。DMSO对照组加入含1.0 g/L DMSO的培养液，实验组EVO的终浓度分别为1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5和15.0 μmol/L，每组3个复孔。分别培养24、48、72 h后，每孔以换液形式加入含有100 g/L CCK-8试剂的培养液，37 ℃孵育1 h，用酶标仪检测450 nm波长下的吸光度（A450）。

1.2.2  PI单染流式细胞术法检测EVO对NCI-H1299细胞周期的影响  取对数生长期的NCI-H1299细胞，用2.5 g/L胰酶消化，制成单细胞悬液，以每孔1×106个接种于10 cm培养皿。第2天，DMSO对照组加入含1.0 g/L DMSO的培养液，实验组EVO的终浓度为12.5 μmol/L，每组3个复孔，培养24 h。处理结束后细胞经胰酶消化，离心、弃上清，加入体积分数0.70的预冷乙醇于4 ℃下保存过夜。以PBS洗涤2次，离心，加入RNase（10 mg/L），室温孵育15 min，加入10 mg/L PI，室温避光孵育30 min，上机检测。

1.2.3  Annexin V+PI双染方法检测EVO对NCI-H1299细胞凋亡的影响  取对数生长期的NCI-H1299细胞，细胞处理同1.2.2。处理结束后细胞经胰酶消化，离心、弃上清，以PBS洗涤2次，离心，加入含5 μL Annexin V和10 μL PI的Annexin V Binding Buffer，室温避光孵育15 min，上机检测。

1.2.4  Western blot检测蛋白表达  取对数生长期的NCI-H1299细胞，细胞处理同1.2.2。用RIPA裂解液提取样品蛋白，BCA蛋白定量后取20 mg蛋白用100～150 g/L SDS-PAGE凝胶电泳分离，湿转膜。将PVDF膜浸入50 g/L BSA封闭液中，室温摇床孵育1 h。加入一抗（以含50 g/L BSA的TBST稀释，稀释比例均为1∶1 000），室温摇床孵育2 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗（以含50 g/L脱脂奶粉的TBST稀释，稀释比例均为1∶5 000），室温摇床孵育2 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。显影。

1.3  统计学方法

采用Flowjo10.4软件分析PI单染流式细胞术与Annexin V+PI双染流式细胞术检测结果，绘制统计图表；采用SPSS 26.0软件进行数据统计分析。正态性分析采用Shapiro-Wilktest检验。计量资料数据采用±s形式表示，组间比较采用student t检验或单因素方差分析；重复测量数据组间比较采用重复设计多水平方差分析，事后检验采用Bonferroni校正法。由于相关线性假设无法成立，故采用stata16.0软件运用局部加权回归散点平滑法（LOWESS）观察二维变量之间的关系，分析3个时间点（处理24、48、72 h）NCI-H1299存活细胞数和给药浓度之间的变化趋势，并进一步采用Bootstrap法验证趋势的稳定性，采用局部多项式回归方法（LOESS方法）对两维散点图进行平滑分析，比较Bcl-2/Bax比值与Bcl-2和Bax的变化趋势。P＜0.05为差异有显著性。

2  结  果

2.1  EVO对人肺癌NCI-H1299细胞的增殖抑制作用

CCK-8检测结果显示，与DMSO对照组相比，1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 μmol/L EVO作用于NCI-H1299細胞24、48、72 h后，能明显抑制细胞增殖，细胞增殖活力随着EVO浓度增加呈下降趋势，不同给药浓度组间比较差异有显著性（F=5 091.83，P＜0.01），不同时间点比较差异有统计学意义（F=1 241.80，P＜0.01），给药浓度与时间存在交互作用（F=673.46，P＜0.01），且细胞增殖活力变化呈浓度和时间剂量依赖性。见图1。局部加权散点回归分析显示，3个时间点（24、48、72 h）NCI-H1299存活细胞数和给药浓度之间的变化趋势基本吻合，每个时间点的细胞存活数均随着给药浓度的增加而下降。见图2。

2.2  EVO对人肺癌NCI-H1299细胞周期的影响

PI单染流式细胞术检测结果显示，12.5 μmol/L EVO作用于NCI-H1299细胞24 h后，与DMSO对照组相比，EVO组G2/M期细胞比例显著上升（t=54.74，P＜0.001）。见图3。另外，与DMSO对照组相比，EVO可以诱导p-Cdc2水平及P53、CyclinB1、Cdc25C（间期）蛋白表达上升（F=13.55～69.14，P＜0.05），Cdc25C（60 000）表达下降（F=34.20，P＜0.05）。见图4。

2.3  EVO对人肺癌NCI-H1299细胞凋亡的影响

Annexin V/APC+PI双染流式细胞术检测结果显示，12.5 μmol/L EVO处理24 h后，与DMSO对照组相比较，EVO组细胞凋亡率明显上升（t=35.52，P＜0.001）。见图5。与DMSO对照组相比，EVO可以诱导caspase-3、caspase-9（37 000）、Bax、PARP1以及caspase-9（35 000）表达（F=21.62～196.54，P＜0.05）。见图6。EVO可以诱导Bcl-2/Bax比值明显下降（F=3.86，P＜0.05）。见图7。

2.4  EVO对人肺癌NCI-H1299细胞程序性坏死的影响

与DMSO对照组相比较，EVO组RIP、RIP3和MLKL磷酸化水平均显著上升，差异有统计学意义（F=71.69～118.33，P＜0.05），即EVO可诱导其活化。见图8。

3  讨  论

EVO是芸香科植物吴茱萸的主要成分之一，属于吲哚喹唑啉类生物碱，具有较好的抗肿瘤作用［7］。本研究结果显示，EVO能显著抑制NCI-H1299细胞增殖，不同给药浓度组之间存在显著差异，且给药

浓度与时间存在交互作用，且细胞增殖活力变化呈浓度和时间剂量依赖性。提示EVO可能对NCI-H1299细胞增殖有抑制作用。研究显示，EVO作用于人乳癌MDA-MB-231细胞或人胃癌SGC-7901细胞后，可诱导细胞G1期阻滞和G2/M期细胞比例升高［8-9］。本文实验结果显示，EVO作用于NCI-H1299细胞后，G2/M期细胞比例明显上升。

抑癌基因p53位于人染色体17p13.1上，编码一种393个氨基酸的内磷酸化蛋白质，称为P53蛋白［10］。Cdc2基因只有与Cyclin结合并经磷酸化/脱磷酸化修饰后才能发挥其活性［11］。CyclinB持续升高可使细胞停滞于分裂期，当细胞发生G2/M期阻滞时，CyclinB不但没有快速降解，反而发生蓄积现象［12］。G2/M期的停滞是由于Cdc家族蛋白和细胞周期蛋白复合体（如Cdc2/CyclinB复合体）的顺序激活和失活所致，该复合体与有丝分裂的进入有关，从而调节G2/M期的转变。Cdc2的Tyr15磷酸化抑制了Cdc2/CyclinB1激酶复合体的活性。Cdc2中Tyr15的去磷酸化是由Cdc25C磷酸酶催化的，该反应被认为是进入有丝分裂的限速步骤［13］。本研究结果显示，EVO处理NCI-H1299细胞后，细胞周期相关蛋白Cdc2磷酸化水平及P53、CyclinB1、Cdc25C（间期）蛋白水平明显上升，提示EVO可使NCI-H1299细胞停滞于G2/M期。

細胞凋亡是一种程序性细胞死亡，细胞凋亡的失控是肿瘤细胞生长和增殖的重要机制之一［6］。抗肿瘤药物可通过内源性线粒体或内质网通路，使细胞内的caspase-9、caspase-7、caspase-3依次被激活，诱导肿瘤细胞凋亡。caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡蛋白酶之一，活化后的caspase-3可诱导细胞程序性死亡［14］。caspase-9是线粒体凋亡通路的关键蛋白酶，一旦激活，caspase-9就会裂解并激活caspase-3和caspase-7，从而导致细胞凋亡［15］。PARP1是研究最多的PARP家族酶之一，是将凋亡诱导因子从线粒体转位到细胞核所必需的，参与了程序性细胞死亡过程［16］。本研究显示，EVO作用于NCI-H1299细胞后，caspase-9、caspase-3和PARP1蛋白剪切型明显上升，提示EVO可能在NCI-H1299细胞内诱导caspase-9、caspase-3以及PARP1的活化。Bcl-2和Bax为细胞凋亡通路中的两种重要的基因，二者的表达是决定细胞在体内受到刺激后是否发生凋亡的重要因素［17］。Bax基因可诱导细胞凋亡，而Bcl-2具有明显抑制细胞凋亡的作用。高Bax和（或）低Bcl-2以及高Bax/Bcl-2比值有利于细胞凋亡［18］。本研究结果显示，EVO作用于NCI-H1299细胞后，Bax蛋白水平明显上升，且Bcl-2/Bax比值明显下降，提示EVO可诱导NCI-H1299细胞内源性凋亡。

程序性坏死是由蛋白激酶介导的非依赖半胱天冬酶，通过受体相互作用的一种新型细胞死亡方式。由RIP1、RIP3以及MLKL组成的蛋白复合物是程序性坏死的关键调控因子［19］。当被病毒感染或者caspase-8激活受抑制时，死亡配体（包括肿瘤坏死因子、FAS配体和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）依次进行磷酸化和激活RIP1、RIP3，活化的RIP3使MLKL磷酸化，导致MLKL的构象变化，p-MLKL形成寡聚体，并易位至生物膜上，通过形成孔道和破坏膜完整性导致坏死［20-22］。本研究结果显示，EVO作用于NCI-H1299细胞后，RIP1、RIP3和MLKL的蛋白磷酸化水平显著上升，提示EVO在NCI-H1299细胞中能够通过诱导RIP1、RIP3和MLKL活化，引起程序性坏死。

综上所述，EVO对人肺癌细胞NCI-H1299具有明显的抗肿瘤活性，其作用机制与细胞增殖抑制、诱导G2/M期细胞周期阻滞、内源性凋亡和程序性坏死有关。然而，这需要进一步的动物体内实验进行验证。

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（本文編辑  牛兆山）