G—RH2诱导人肺腺癌A549细胞凋亡的实验研究

张悦萌　张大力　安昌善

【摘要】 目的 探讨人参皂甙RH2（G-RH2）对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响。方法 分析G-RH2对A549细胞周期及细胞凋亡的影响， 并检测G-RH2对A549细胞相关基因表达的影响。结果 0～60 μmol的G-RH2作用A549细胞72 h后， 实验组G1期细胞比率随药物浓度的增加而增加， S期细胞比率随药物浓度的增加而递减， G2期细胞无明显变化。Bax、Bid及Cyto-C表达量随药物浓度增加而增加， Bcl-2、细胞外信号调节激酶（ERK）及P-ERK表达量随药物浓度的增加而降低。结论 G-RH2可以诱导人肺腺癌A549细胞凋亡， G-RH2抗肿瘤药物值得临床开发和应用。

【关键词】 人参皂甙RH2；肺腺癌；A549细胞；细胞凋亡

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.11.215

G-RH2， 即四环三萜类寡低糖链人参二醇型皂甙单体， G-RH2可以通过诱导分化或者诱导调亡， 抑制多种肿瘤细胞的生长、增殖， 而且其具有很强的抗肿瘤活性[1]， 本实验以人源肺腺癌细胞A549为研究对象， 主要运用流式细胞技术检测G-RH2处理的A549细胞周期改变情况， 最后从蛋白水平用Westen blotting方法验证特定蛋白表达水平的变化， 探讨其发挥抗肿瘤效应的关键蛋白及分子信号传导通路， 希望通过研究能促进G-RH2抗肿瘤药物的进一步开发和更广泛的临床应用。现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料 延边大学药学院药物分析实验室提供的人肺腺癌A549细胞系。

1. 2 方法 从-80℃冰箱中取出A549细胞冻存管先进行细胞复苏、细胞培养及细胞传代， 用G-RH2处理A549细胞， 采用流式细胞技术分析G-RH2对A549细胞周期及细胞凋亡的影响；对G-RH2处理A549细胞提取蛋白质并测定蛋白质浓度， 电泳， 并用Westren blotting化学发光显影定影检测G-RH2对A549细胞相关基因表达的影响。

2 结果

2. 1 G-RH2对A549细胞周期及凋亡的影响 分别以 0、10、20、40、60 μmol的G-RH2作用A549细胞72 h后， G1期细胞比率分别为（61.3±2.1）%、（65.4±1.8）%、（68.9±2.4）%、（78.8±1.7）%、（85.3±1.5）%； S期细胞比率分别为（26.3±2.1）%、（22.3±2.4）%、（16.3±1.5）%、（11.3±1.5）%、（9.3±2.3）%；G2期细胞比率分别为（12.4±1.3）%、（12.3±1.4）%、（14.8±2.0）%、（9.1±1.7）%、（6.4±1.3）%， 经比较可见G-RH2作用于A549细胞后， A549细胞的凋亡比率呈浓度依赖性递增， G1期细胞比率随药物浓度的增加而增加， S期细胞比率随药物浓度的增加而递减， 波峰前移， G2期细胞无明显变化。

2. 2 G-RH2对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响 分别以0、10、20、40、60 μmol的G-RH2作用A549细胞72 h后， Western bolt法检测Bcl-2家族系列蛋白的表达变化， 以β-actin为内参对照。Bax的表达量分别为（112.56±0.65）%、（123.77±2.17）%、（136.74±1.17）%、（147.61±0.77）%、（159.38±0.53）%；Bcl-2的表达量分别为（183.28±0.79）%、（178.31±1.35）%、（177.90±1.24）%、（166.96±0.47）%、（147.15±1.41）%；Bid的表达量分别为（97.18±0.60）%、（99.94±0.06）%、（105.02±0.99）%、（104.95±0.53）%、（126.98±0.43）%；Cyto-C的表达量分别为（108.38±0.51）%、（114.44±0.30）%、（122.68±0.46）%、（126.26±0.59）%、（133.04±0.44）%；EPK的表达量分别为（46.28±0.10）%、（58.74±0.53）%、（89.31±0.69）%、（49.53±0.50）%、（38.90±2.11）%；P-ERK的表达量分别为（160.26±0.59）%、（169.32±0.37）%、（173.62±0.44）%、（174.03±0.64）%、（181.71±0.51）%；经比较可见G-RH2作用A549细胞后， Bax、Bid及Cyto-C表达量随药物浓度增加而增加， Bcl-2、ERK及P-ERK表达量随药物浓度的增加而降低。

3 讨论

流式细胞仪检测肯定了G-RH2诱导A549细胞凋亡的作用。阻滞细胞周期是诱导肿瘤细胞凋亡的方式之一， 其中最易受到影响的是分子变化最为活跃的G1-S期以及G2-M期， 药物作用于这两个时期就可以干扰细胞周期的运行， DNA合成受阻， 从而抑制细胞的增殖和生长[2]。本实验结果显示：G-RH2作用于A549细胞后， A549细胞G1期细胞依次增高， S期细胞则依次减少， G2期细胞无明显变化， 提示G-RH2对于A549的细胞周期调节作用， 主要发生在G1期， 可将细胞周期阻滞在G1期， 阻止其向S期的发展。

在细胞凋亡过程中， Bcl-2家族起着非常重要的作用， 其诱导细胞的线粒体凋亡途径。本研究中对Bcl-2家族主要研究Bax、Bcl-2、Bid的影响。Bcl-2是细胞凋亡的负调控因子， Bax起着促进细胞凋亡的作用， Bid可以接受细胞内的死亡信号[3]。Cyto-C是线粒体凋亡途径的关键蛋白， 可反映Bcl-2家族蛋白对线粒体的调控作用[4]。本实验分别以0～60 μmol的G-RH2作用A549细胞72 h后， 发现Bax、Bid及Cyto-C表达量随药物浓度增加而增加， Bcl-2表达量随药物浓度的增加而降低。

ERK是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的一员， 参与细胞生长、繁殖、分裂、分化等各个方面， P-ERK即磷酸化的ERK可影响细胞增殖和调控[5]。本实验中分别用0～60 μmol的G-RH2作用A549细胞72 h后， 结果发现ERK及P-ERK表达量随药物浓度的增加而降低。

综上所述， G-RH2通过引发A549细胞G1期细胞周期阻滞， 抑制细胞增殖， 并通过下调Bcl-2的表达， 上调Bax及Bid的表达， 增加Cyto-C的释放， 诱导A549细胞凋亡；也可能是通过下调P-ERK及ERK的表达抑制A549细胞增殖。

参考文献

[1] 朴丽花， 金政， 蔡英兰， 等.人参皂甙Rh2抗乳腺癌细胞细胞侵袭和转移的实验研究.中国临床药理学杂志， 2011， 27（11）： 867-870.

[2] Yi PF， Bi WY， Shen HQ， et al. Inhibitory effects of sulfated 20（S）-ginsenoside Rh2 on the release of pro-inflammatory mediators in LPS-induced RAW 264.7 cells. European Journal of Pharmacology， 2013， 712（1-3）：60-66.

[3] 史婷婷， 白建平， 梁月琴， 等.芹菜素对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡及相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响.中国药理学通报， 2011， 27（5）：666-670.

[4] Chang Z， Xing J， Yu X， et al. Curcumin induces osteosarcoma MG63 cells apoptosis via ROS/Cyto-C/Caspase-3 pathway. Tumour biology， 2014， 35（1）：753-758.

[5] 赵明哲， 刘靖华， 李玉花， 等.ERK信号通路的信号转导调控机制.国际病理科学与临床杂志， 2009， 29（1）：15-19.

[收稿日期：2015-12-04]