人类microRNA—1246慢病毒抑制载体的构建以及鉴定

赖月华　姚德生　杜萍　卢艳

摘要：目的 构建microRNA-1246慢病毒抑制载。方法 针对microRNA-1246成熟体的反义核苷酸片段， 应用基因重组技术将目的基因片段克隆到GV280慢病毒载体中，通过酶切、PCR、DNA测序验证重组克隆的成功构建，将GV280-mir-1246down、Helper1.0、Helper2.0共转染293T细胞获得重组慢病毒， 浓缩提纯病毒液并检测病毒滴度，用病毒液感染siha细胞，通过检测绿色荧光蛋白（GFP）验证GV280-mir-1246down在siha细胞的表达情况，用嘌呤霉素筛选GV280-mir-1246down稳转细胞株。用细胞计数的方法检测细胞的生长率。结果 ①对菌落进行PCR鉴定筛选出构建正确的慢病毒载体，DNA测序证实插入的基因序列正确；②GV280-mir-1246down、Helper1.0、Helper2.0共转染293T细胞产生重组慢病毒；③目的mir-246down被慢病毒成功导入siha细胞中，同时达到稳定表达，转到率几乎达100%，荧光显微镜下能直接观察到GFP；④细胞计数结果显示在siha细胞中microRNA-1246的下调细胞的生长速度减弱。结论 成功构建microRNA-1246慢病毒抑制载体，建立siha细胞mir-1246-down的稳转株，microRNA-1246在siha细胞中下调的siha细胞的增殖能力下降.这为研究microRNA-1246在宫颈鳞癌siha细胞的作用及其机制提供了可靠的基础。

关键词：慢病毒载体；microRNA；抑制载体；宫颈癌；细胞增殖

Construction and Identifacation of a Lentiviral Vector for MicroRNA-1246 of Human Inhibition

LAI Yue-hua，YAO De-sheng，DU Ping，LU Yan

（ Department of Gynecologic Oncology，The Affiliated Tumor Hospital，Guangxi Medical University，Nanning 530021，Guangxi，China）

Abstract：Objective To construct and identify a lentiviral vector for microRNA-1246 inhibiton.Methods The gene sequences of microRNA-1246 Antisenseolignuclleotides were chosen， the antisense sequences of microRNA-1246 were designed and linked into linearized GV280 vector. The recombinants were screened and identified by colony PCR and DNA sequencing， The GV280-mir-246down，Helper1.0、Helper2.0 were mixed in suitable proportion and then transfected into the cell of 293T to get recombinant lentiviral vector.The concentrated and purified of virus bulk were detected the drops of it，indeed the virus was used to infect the carcinoma cell of Cervical squamous of siha .The GV280-mir-1246down，s expression in the siha cell tested by testing the GFP.Results ①The corrected of recombination lentiviral vector was screened from the bacterial which was anthenticated by PCR，DNA testing proved that the inserted gene sequence was correct . ②The cells of 293T which was transfected GV280-mir-1246down、Helper1、0 and Helper2.0 produced recombinant lentiviral vector.③The target gene sequences were successfully inserted into siha cell by GV280 lentiviral vector ，the recombinant lentiviruses which carring mir-246down could infect and deliver mir-246down and GFP genes to siha cells. The infection efficiency was almost 100%. Conclusion The lentiviral microRNA inhibitor vector has been successfully constructed，which provides a stable tool for further study of therole of microRNA-1246 on cervical cancer.

Key words： Lentiviral vector；MicroRNA； Inhibiton vector；Cervical cancer；Cell proliferation

MiRNA是一类由20-23个碱基组成的非编码单链RNA，MiRNA与靶基因mRNA的非翻译区域的碱基互补配对，MiRNA与靶基因mRNA结合形成沉默复合体使mRNA降解，从而阻碍mRNA的翻译[1]。肿瘤细胞的多种生物学行为受到MiRNA的调控，MiRNA的功能与细胞的分化、增殖、凋亡、耐药、侵袭及转移等密切相关[2]。我们的前期实验表明microRNA-1246的表达量在宫颈癌患者的癌组织中较正常人宫颈组织升高，microRNA-1246的表达量在宫颈癌患者的癌组织中较癌旁组织升高，microRNA-1246是一个促癌因子，miR-1246对人宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭、迁移能力具有一定的影响[3]。慢病毒（Lentivirus）载体是将人类免疫缺陷I型病毒（HIV-1）改良后发展起来的用于基因治疗的载体，是逆转录病毒的一种。它对非分裂细胞和分裂细胞均具有较强的感染能力，该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达，因为对该病毒进行了改良，使之失去了传染性能，因此安全性高。作为干预宫颈鳞状细胞癌生长及体内试验的措施之一，我们构建了miR-1246慢病毒过表达载体及抑制载体，为进一步观察miR-1246在宫颈鳞状细胞增殖中的作用及其机制奠定了基础。

1 资料与方法

1 一般资料

1.1.1细胞来源以及培养 人胚胎肾细胞（293T）、人宫颈鳞状细胞癌细胞（siha）均购于上海中国科学院。293T细胞用含10%的FBS的DMEM培养，siha用含10%的FBS的1640培养。

1.1.2质粒及菌株 携带增强绿色荧光蛋白（EGFP）的慢病毒载体GV280以及Helper1.0 、Helper2.0购自上海吉凯基因科技有限公司。GV280具有绿色增强荧光蛋白（EGFP）标志和ampricillin抗药基因。感受态大肠杆菌DH5α菌株购于北京天根生物科技公司。

1.1.3主要试剂 限制性内切酶AgeⅠ、EcoRⅠ限制性内切酶 T4DNA连接酶购自NEB公司，DL10，000 DNA Marker购于上海TaKaRa公司，2×Taq PCR Master Mix购于上海吉凯基因科技有限公司，质粒DNA提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自北京天根生物科技公司，PCR引物合成及质粒测序由上海吉凯基因科技有限公司进行。

1.2方法

1.2.1引物设计及合成 根据mirBase数据库得到hsa-miR-1246 MIMAT0005898 AAUGGAUUUUUGGAGCAGG据DNA重组要求及其他文献[4]报道，设计抑制载体上游引物5 AATTCAAAAAA-ATGGATTTTTGGAGCAGG-3，下游抑制载体引物5- CCGG - CCTGCTCCAAAAATCCATT -3。在上游引物的5端及3端分别加入限制性内切酶AgeⅠ及EcoRⅠ酶切位点及相应的保护碱基，在上游引物的3端加入6个T作为终止子。

1.2.2重组慢病毒质粒的构建 microRNA-1246抑制GV280载体，GV280转化感受态大肠菌DH5α进行质粒扩增，质粒大提后获得足够量的GV280载体。GV280质粒用限制性内切酶AgeⅠ及EcoRⅠ酶切，按照酶切说明书操作，置于37°反应3 h或过夜，对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，并测定其浓度。对引物进行PCR扩增得到相应的DNA产物，并对PCR产物进行电泳鉴定。PCR产物与双酶切线性化载体以2：1的比例在T4DNAligase作用下进行连接，按照说明书操作，16°连接3 h或过夜。连接产物直接转化感受态细胞，涂布于含氨苄霉素的LB固体培养基的平板上孵育，37°5%的CO2培养过夜。

1.2.3重组慢病毒质粒的鉴定 挑取固体LB培养板上长出的单颗菌落接种于含有氨苄霉素的5ml LB液体培养基进行培养，分好组，并置于37°、200 r/min的恒温摇床振荡，10～16 h后行对液体培养基中的大肠杆菌行PCR鉴定，引物为载体测序引物，对 GV280-mir1246-down插入基因microRNA-1246进行自动测序，与microRNAbase中反义核苷酸序列比较。将阳性克隆的培养菌液取100 μl送测序检查，测序采用下游测序引物进行反向测序。测序结果与原始序列进行比对。将正确插入载体质粒的转化菌放入500 ml含氨苄霉素的LB培养液中，37°振荡过夜，用无内毒素质粒大提试剂盒按照厂家提供的说明书提取质粒DNA，测定浓度（1 ug/ul）和纯度，用作以后的转染。

1.2.4 GV280-mir-1246down质粒表达GFP的检测 用lipo200分别将重组质粒转染293T细胞，于转染24 h后在荧光显微镜下可观察绿色荧光蛋白GFP的表达。

1.2.5 GV280-mir-1246down重组慢病毒的包装与质量检测 包装质粒Helper1.0、Helper2.0分别感受态大肠杆菌DH5α进行扩增，接种于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，挑取单颗克隆菌落于5 ml的LB培养基扩增，用无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒并检测质粒浓度。用lipo2000将GV280-mir-1246down+ Helper1.0、Helper2.0共转染包装细胞293T.48～72 h，收集培养液上清，1500 r/min离心5 min去除细胞碎片。再用孔径为0.45 um的一次性细胞滤器过滤去除所有的细胞及碎片，获得的培养基液上清则分别为含有microRNA-1246、GFP基因的重组病毒。同时将GV280、Helper1.0、Helper2.0共转染293T细胞（空载载体对照，重组病毒仅携带GFP基因）。

1.2.6慢病毒低度检测 采用逐孔稀释法，测定前1 d，将293T细胞接种于96孔板，每孔加入4×104个细胞，体积100 μl。分为8个组，第一组加入的病毒原液为1E+1μl；以此类推到第八个组分别为1E+0μl、1E-lμl、1E-2μl、1E-3μl、1E-4μl、1E-5μl、1E-6μl。感染病毒液24 h后在显微镜下观察细胞荧光数，则该病毒的滴度就等于发荧光的细胞数除以病毒的原液量。

1.2.7慢病毒感染siha细胞 感染前先做预实验检测siha细胞的moi值，感染前1 d将siha细胞以5×104/ml的密度接种于24孔板（细胞融合率为30%～40%），分为3个组，分别为空白组、阴性对照组、mir-1246down，感染前1 h换成Enhance Infection Solution，然后按预实验所得moi值加入病毒量及polybrene，8 h后换成有血清培养基，分别于24 h、48 h、72 h在荧光显微镜下观察细胞荧光表达量。

1.2.8 siha细胞稳转株的筛选；慢病毒感染siha细胞72 h后当细胞长满到90%以上，将细胞用胰酶消化，离心，（预实验检测得嘌呤霉素筛选的最适浓度为2 ug/ml）用含有2 ug/ml嘌呤霉素的培养基制成悬浊液种到6孔板中，每天用2 ug/ml嘌呤霉素的培养基换液。

1.2.9细胞增殖实验 将长到80%生长对数期的细胞消化收集种于96孔板，每孔细胞约3000个/100ul，每组设2平行组，各3个复孔，种2个板。接种后48 h起开始消化收集细胞进行计数，每隔24 h一次，连续6 d。消化下来的细胞加入台盼蓝，盼蓝拒染法进行细胞计数，绘制生长曲线。

1.3统计学分析处理 数据采用 SPSS 16.0 软件分析，多组均数间的比较采用方差分析 F 检验，组间两两比较采用 q 检验，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1酶切鉴定结果， AgeⅠ/EcoRⅠ分别酶切GV369及GV280

，1%琼脂凝胶电泳，紫外线下可见2个DNA片段，与理论计算片段一致。见图1。

2.2菌落PCR结果 对LB培养板上的菌落进行PCR筛选鉴定，可见多数菌落均为阳性克隆（图1），抑制载体酶切产物分别为阳性转化子PCR产物大小：271bp。

2.3载体测序结果 载体经测序证实结果符合预期，插入目的基因片段与线性载体连接正确，符合设计要求，未见碱基缺失或突变等异常，证实已成功构建此两类载体，借助Vector NT软件，将序列导入。绘制质粒GV280-mir1246-down结构图。

2.4基因转导效率的检测结果 用重组慢病毒介导GV280-mir-1246down转导入宫颈鳞癌siha细胞，重组病毒感染siha细胞48h后，将六孔板板放在显微镜下，可见到几乎100%的活细胞表达GFP见图3。

2.5 siha细胞稳转株，用嘌呤霉素筛选后anti-miR-1246-LV，病毒转染率几乎为100%。

2.6细胞增殖实验结果 我们发现通过感染anti-miR-1246病毒下调miR-1246的表达能够明显抑制宫颈癌细胞的增殖，P<0.01，差异有统计学意义。这说明miR-1246在促进宫颈癌细胞生长方面起到一定作用。

3讨论

最近的研究表明microRNA参与生理或疾病状态的调节，其中包括细胞死亡或凋亡，肿瘤的发生、发展、发育以及炎症反应等[5]。为了更为深入地阐明microRNA的作用机制，microRNA的功能学研究是不可或缺的。MicroRNA过表达或抑制表达的功能学可以采用很多方法，其中主要包括运用体外合成的mi-croRNA化学模拟物和抑制物或构建相关载体进行转染[6]。针对宫颈鳞癌siha细胞分裂增殖性能差及其真核载体转染率低下的特点，本研究在以往实验的基础上构建了相关microRNA的慢病毒载体，为下一步载体的包装及假病毒颗粒的制备做好准备。慢病毒载体是体内体外基因转染的有力工具，该系统往往由3部分组成，即携带目的基因的载体质粒。提供病毒结构部件（gag/pol）质粒以及提供病毒衣壳的质粒构成[7]。其主要有以下优势。首先，慢病毒不仅能够转染分裂期细胞，而且对分裂较慢的细胞甚至非分裂期的终末分化细胞具有同样的转染作用；其次，慢病毒所携带的目的基因更能够耐受转录沉默；最后，慢病毒能适合各种普遍的或组织特异的转录启动子，而且慢病毒自我失活的修饰在不降低病毒的滴度的情况下能使目的基因的表达在靶细胞内受内源性启动子单独的调控[8]。

本研究采用的GV280质粒，来源于HIV-1构件，所构建的载体中携带的目的基因在EMCV IRES的下游，具有EGFP荧光蛋白基因，能为目的基因的表达提供可靠的保证[9]。MicroRNA过表达载体的构建可以采用microRNA的前体序列作为目的基因插入载体，也有研究采用的是包含microRNA前体序列两端的侧翼序列在内的核苷酸并经基因组DNA扩增后作为目的基因插入[10]。一般情况下当细胞内microRNA高水平表达时采用反义寡核苷酸抑制其活性来下调其表达水平是目前比较理想的loss-of-fuction研究手段。

本实验结果显示，成功构建了慢病毒microRNA过表达表达质粒GV280-mir-1246down，具有极高的转染效果，几乎可以使100%的靶细胞获得目的基因，因为它带有GFP，可以通过荧光显微镜观察有无绿色荧光GFP来了解靶细胞是否被转导了目的基因，而无需繁琐的免疫组化或者PCR方法验证，简化了实验过程，目的基因可在2～3 d内转导入100%的靶细胞，达到稳定表达。为转基因的研究提供了快速、有效的工具，同时也为基因治疗提供了有力的依据。细胞增殖实验显示，MiR-1246的下调可以抑制宫颈癌siha细胞的增殖能力，MiR-1246是宫颈鳞状上皮癌的致癌基因，它的下调表达可以明显的抑制宫颈癌细胞的增殖。

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编辑/金昊天