传染性法氏囊病致病机理研究

尹伟+孙启才

【摘 要】传染性法氏囊病（IBDV）是目前危害世界养禽业的主要传染病之一。本文对传染性法氏囊病作了简介，从IBDVD 病理组织学、细胞免疫学、抗原变异、毒力以及病毒复制入手，探讨IBDV的致病机理。从IBDV 诱导细胞凋亡，炎症反应，免疫抑制等方面探讨其分子致病机理。随着对传染性法氏囊病毒致病机制研究的不断深入，以期为设计抗病毒药物奠定基础，为该病的预防提供理论依据和线索。

【关键词】传染性法氏囊病；细胞凋亡；致病机理

0 前言

传染性法氏囊病（IBDV）是目前危害世界养禽业的主要传染病之一。该病被发现已有半个世纪，至今仍一直遍布世界各养禽区域，在工业化养禽业发达国家尤甚。近年来，超强毒株和变异毒株的出现使得该病的发生和流行出现了新的特点，对养禽业的造成了巨大危害。深入了解该病的致病机制，提供有效地预防和控制该病的策略，具有重大的现实意义。IBDV的分子致病性研究经历了几个阶段：早期主要通过病理组织学变化、细胞免疫学分析进行研究，随后伴随着分子生物学技术的发展，研究主要集中在与抗原变异、毒力以及病毒复制上，而目前主要通过高通量的方法筛选与病毒蛋白互作的宿主蛋白，然后进一步对筛选的相互作用蛋白进行验证，该方法的应用使得越来越多的致病性相关的因子被揭示，为进一步来阐释病毒的分子致病机理奠定了理论基础。

1 传染性法氏囊病简介

传染性法氏囊病（infectious bursal disease， IBD）是禽类的一种病毒性免疫抑制性疾病，病毒主要通过侵害3-6周龄雏鸡的法氏囊中枢免疫器官，破坏表面带有sIgM的B淋巴细胞，并引起脾脏、胸腺及外周血液淋巴细胞的凋亡，导致以淋巴细胞衰竭、坏死为主要特征的一种免疫缺陷性和免疫抑制性疾病，其所致的急性炎性反应和细胞凋亡结果使B淋巴细胞急剧减少，导致免疫抑制，使感染鸡对其他病原的易感性增强 ，根据病毒中和特性不同可将IBDV分成对鸡和火鸡均致病血清Ⅰ型和只对火鸡致病的血清Ⅱ型。根据抗原性变异和毒力的不同，血清Ⅰ型毒株又分为经典毒株（classical virulent IBDV， cIBDV）、疫苗株（attenuated IBDV）、抗原变异毒株（antigenic variant IBDV）和超强毒株（very virulent IBDV， vvIBDV）[1]。

传染性法氏囊病是一种高度接触性传染病，自然条件下，该病的传播主要以口腔传播为主，也可经蛋垂直传递，各种用具、人员及昆虫也可以携带病毒，进行扩散传播。病毒进入体内主要通过巨噬细胞的吞噬作用扩散到其他组织和器官。经典毒株可引起感染鸡群法氏囊炎症和严重的淋巴细胞坏死，法氏囊水肿，导致免疫抑制和一定水平的死亡率。一般来说，感染后第3天是死亡高峰期，但感染后5-7天仍有死亡发生，使得整个鸡群死亡率可高达20%-30%。疫苗株是经鸡胚成纤维细胞或其他细胞系适应的毒株，对鸡不致病，因此一些毒株可作为活苗免疫鸡群。超强毒株，该病原能引起典型的IBDV损伤，法氏囊严重出血，外观呈“紫葡萄状”，现已大面积流行于欧洲、东南亚、非洲等。其致死率高达60%-100%。抗原变异毒株的特点在于能够突破经典疫苗毒株的免疫保护，与抗经典毒株血清交叉中和，感染变异毒株的鸡群法氏囊严重萎缩却不表现炎性症状。

IBDV属双RNA病毒科（Birnaviridae）禽双RNA病毒属（Avibirnavirus）。病毒粒子呈二十面体对称，无囊膜，T=13晶格分布，直径约60 nm。病毒基因组为双股双节段RNA（double-stranded RNA， dsRNA），有A和B两个片段组成。病毒基因组A片段全长由约3.3 kb核苷酸组成[2]，包含两个部分重叠的开放阅读框（open reading frames， ORFs）。

2 IBDV的致病机理

2.1 IBDVD 病理组织学、细胞免疫学研究

病毒感染宿主后主要临床表现包括精神高度萎靡、缩头、闭眼、呆立，羽毛蓬松，采食量明显减少，饮水急剧增加，白色水样稀粪，自啄肛门。该病往往突然发生，通常在感染第3天开始死亡，4-6天达到高峰，以后很快停息，表现为高峰死亡和迅速康复的曲线。当前传染性法氏囊病呈现出新的特点，近年来国内外陆续报道分离出IBDV变异毒株，其致病特点以出现亚临床传染性法氏囊病症状为主，没有经典毒株所致的高死亡率及典型的腿肌出血等症状，不引起明显的炎症反应，感染鸡群死亡率不高，但可引起肝脏坏死和明显的脾脏肿大，最典型的病变是病鸡法氏囊迅速萎缩，导致严重的免疫抑制。而且发病日龄呈现两极化趋势，发病越早，免疫抑制越严重，传染性法氏囊病继发症增多。免疫学研究认为法氏囊是IB DV的靶器官，其中B 细胞对IBDV 敏感， 带sIg M 的B 细胞为IBDV的主要靶细胞，而胸腺T 细胞对IBDV不易感，有报道指出， 感染IBDV 雏鸡胸腺细胞出现坏死变化[3]，1日龄雏鸡感染IBDV 后外周血液白细胞数量减少。

2.2 抗原变异、毒力以及病毒复制

2.2.1 抗原变异与毒力

VP2高变区内的两个大亲水区、三个小亲水区是构成IBDV抗原变异的分子基础。第1个亲水区的氨基酸不直接结合mAbs，主要起稳定抗原表位构象的作用，变异株E的213和222位氨基酸的突变引起VP2蛋白的中和性表位的构象改变；第2个亲水区的2个氨基酸突变可能对变异株逃逸病毒中和抗体的能力是一个关键，且对结合mAbs的特异性也至关重要。这2个亲水区是病毒中和表位的组成部分，特别是第2个亲水区的氨基酸改变导致变异株E对标准株疫苗介导的抗体中和作用有抵抗力各标准株的亲水区序列完全保守，而在变异株中却有数量不等的氨基酸被替代。第一个大亲水区（212-224aa）残基置换不影响抗体结合，但对抗原的构象稳定性有较大的影响[4]，而第二个大亲水区（314-324aa）是单抗结合必需的，该区的氨基酸替代可致变异株逃逸抗体的中和作用。

2.2.2 IBDV的复制

IBDV的复制和增殖是研究其生物学特性的基础，IBDV能够在多种类型的细胞中复制，如鸡源细胞： 鸡胚法氏囊细胞（ CEB ）、鸡胚肾细胞（CEK ）、鸡胚成纤维细胞（CEF） ；非鸡源细胞包括火鸡胚成纤维细胞 （ TEF）， 鹤鹑胚（ QEF ）成纤维细胞，鸭胚成纤维细胞（ DEF ）， 兔肾细胞 （ PK-13 ）， 幼绿猴肾细胞（ BGM-70 ），猴肾细胞（ Vero）。IBDV在细胞中的增殖周期因细胞而异。Burkhardt等发现血清I 型IBDV在CEF中潜伏期为4-6 h 。目前研究中积累了大量的不同IBDV毒株在各种细胞中增殖特点的资料，阐明了组成病毒各蛋白组分的特点和功能，测定了一些病毒的全部核苷酸序列，提出了病毒致病力和抗原性差异的一些分子基础，但对病毒增殖过程、病毒与敏感细胞间相互作用的机制仍知之较少。其原因主要有： 即使在产生高滴度病毒时，也仅仅是有限的培养细胞被感染而支持病毒的复制。目前研究结果发现IBDV 可能通过受体介导接入宿主细胞进行复制，已发现的相关受体有细胞膜上的a4β1整合素（integrin）、鸡热应激蛋白-90（HSP90）以及B 细胞表面IgM（sIgM）。

3 IBDV分子致病机理

3.1 IBDV 诱导的细胞凋亡

IBDV感染引起细胞凋亡和细胞坏死是法氏囊内淋巴细胞衰竭的两个重要原因。细胞凋亡是指机体清除多余、变异或恶化细胞的一种主动的、程序化的生理过程。体外试验表明， IBDV可以引起多种动物细胞系发生凋亡。且各细胞系发生凋亡的时间各不一样，CEF 细胞在感染早期（ 病毒吸附CEF后）就可诱导凋亡发生，而Vero细胞则在感染够6小时才开始凋亡。大量研究表明，细胞凋亡过程中需要新的基因表达，而且细胞膜、细胞质、细胞核以及原癌基因、细胞周期蛋白、细胞骨架、受体和信号转导系统、细胞因子和免疫蛋白等都与细胞凋亡密切相关。叶研究比较了IBDV感染前、后两个Vero文库间基因表达的差异，将显著差异基因的KEGG和Bioarta数据库内进行搜索与分析，初步分析显现，在IBDV感染过程中细胞凋亡的可能机制之一是：Gadd45a结合EF-1α蛋白，抑制其稳定微管聚合的作用，Bim蛋白得以由细胞骨架解离并转位于线粒体，导致细胞色素C释放，激发线粒体凋亡途径。这提示细胞受到损伤后细胞骨架稳定性的改变在细胞凋亡发生过程中起重要作用。生物内环境的稳定不但依赖于细胞的增殖分化，也依赖于细胞的凋亡。目前认为dsRNA主要通过活化PKR和OAS/RnaseL通路抑制蛋白合成或dsRNA敏感机制激活Caspase-8途径诱导凋亡[5]。然而，病毒复制依赖于宿主细胞器的合成功能，如果细胞凋亡过快，病毒则不能完成复制，故有些病毒本身又带有抑制细胞凋亡因子，延缓细胞死亡有利于病毒的复制。

3.2 IBDV 诱导的炎症反应

宿主T 细胞可抗拒IBDV病毒感染并促进病毒清除，但是其调节机制还不清楚。Abdul Rauf等人通过CD4+ 和 CD8+ T细胞渗入法氏囊对病毒分子致病机制和细胞毒性T细胞的病毒清除机制进行了研究。研究结果表明：一些重要的细胞因子如穿孔素（PFN）、粒酶A（Gzm-A）、DNA修复凋亡蛋白、高速流动性蛋白（HMG）、多聚ADP核糖聚合酶（PARP）、Th1、 IL2 和 IFN-r显著上调，而表达的自然杀伤细胞裂解素则显著下调。显著表达上调的Th1、 IL2 和 IFN-r，证明了T细胞的激活。巨噬细胞在先天性和获得性免疫中扮演着重要角色，病毒感染后可调节宿主免疫系统增强或减弱巨噬细胞功能从而引起免疫发病或者免疫逃逸。M. Khatri等人建立了一个IBDV病毒和巨噬细胞在急性感染阶段的互作模型，并证明了IBDV感染后可激活巨噬细胞分泌细胞因子和化学物质来促进局部炎症和组织损伤细胞因子可广泛调控机体免疫应答，但有关IBDV感染引起细胞因子变化的鲜有报道，最近，刘等人研究发现不同毒力的IBDV可诱导鸡体内细胞调节免疫相关细胞因子的表达，细胞因子在超强毒株感染的急性阶段扮演着重要角色，且不同毒力的IBDV株通过不同的信号通路引起免疫反应。

3.3 IBDV的免疫抑制

1972年， Faragher等人首次报道了IBDV感染后引起雏鸡的免疫抑制现象，他们通过研究不同日龄的雏鸡在感染IBDV后，新城疫抗体产生的情况，发现1日龄的雏鸡感染IBDV后，对新城疫疫苗免疫后抗体的产生有明显的抑制作用，并且这种抑制作用会随感染病毒雏鸡日龄的增大而显著下降，当14或21日龄雏鸡感染后，这种抑制作用已不再明显。随后的研究证实[6]，IB D V 感染不仅引起雏鸡全身体液免疫和细胞免疫功能显著抑制， 而且导致消化道和呼吸道局部的体液免疫和细胞免疫水平也明显降低。此外，研究者也证实IBDV的免疫抑制效应因毒株不同而表现不同。最新有关传染性法氏囊病引起免疫抑制的机理研究，王永强等人发现VP4 能抑制宿主细胞I 型干扰素的表达，并通过酵母双杂和CO-IP及激光共聚焦技术发现了VP4作用于宿主细胞靶蛋白GLIZ（糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白）。RNAi技术也证实了VP4通过GLIZ 抑制I型干扰素的表达以及子代病毒的复制。该结果初步揭示了IBDV 引起免疫抑制的分子机理。

4 小结

法氏囊是IBDV感染的靶器官，其所致的急性炎性反应和细胞凋亡结果使B淋巴细胞急剧减少，导致免疫抑制，使感染鸡对其他病原易感性增强。IBDV还能感染巨噬细胞，产生不同的细胞因子和化学因子，在IBDV感染宿主的过程中发挥作用。随着对传染性法氏囊病毒致病机制研究的不断深入，为设计抗病毒药物奠定了基础，为该病的预防和控制制提供了理论依据和线索。

【参考文献】

[1]M. Khatri J.M. Sharma Modulation of macrophages by infectious bursal disease virusCytogenet Genome Res 117：388-393.

[2]Liu， H.， M. Zhang， et al.“Comparison of the expression of cytokine genes in the bursal tissues of the chickens following challenge with infectious bursal disease viruses of varying virulence.”Virol J 2010.7：364[Z].

[3]Stricker RL， Behrens SE， Mundt E.Nuclear factor NF45 interacts with viral proteins of infectious bursal disease virus and inhibits viral replication.J Virol. 2010[Z].

[4]Cui X， Nagesha HS， Holmes IH. Identification of crucial residues of conformational epitopes on VP2 protein of infectious bursal disease virus by phage display[J].J Virol Method，2003，109：75-83.

[5]Heine HG， Haritou M， Failla P， et al. Sequence analysis and expression of the host-protective immunogen VP2 of a variant strain of infectious bursal disease virus which can circumvent vaccination with standard type I strains[J]. J Gen Virol， 1991，72（Pt8）：1835-43.

[6]Li， Y.， C. Wang， et al. .“Synonymous codon usage of the VP2 gene of a very virulent infectious bursal disease virus isolate serial passaged in chicken embryos.”[J] .Biosystems 2011，104（1）：42-47.

[责任编辑：王伟平]