MALDI-TOF-MS用于微生物鉴定的影响因素分析

2019-02-22徐淑菲孔繁德林双庆蔡绍鑫

中国动物检疫 2019年2期

徐淑菲，孔繁德，林双庆，蔡绍鑫

（厦门出入境检验检疫局，福建厦门 361026）

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是一种简单和高效的新型软电离生物质谱。MALDI-TOF-MS是依赖仪器的生物化学分析技术，仪器精准度、样品处理方法、基质选择以及一些人为因素都会对结果产生直接影响[1-2]。

在进行细菌培养时，培养基可能会影响细菌性状的变化。Holland等[3]研究了用3种培养基培养福氏志贺菌后得到的质谱图，发现变化很小，特有生物标记物的峰没有发生变化，不会影响细菌鉴别。

应用MALDI-TOF-MS进行细菌检测时，细菌培养时间是一个非常重要的变量。Arnold等[4]研究了不同培养时期（6～84 h）细菌质谱峰的变化，发现不同培养时期的细菌质谱峰有明显差异。同时他们对保存了30 d的细菌及初代培养细菌进行检测，发现质谱蜂有差异，而初代培养与再培养（Recultured bacteria）细菌质谱蜂基本相同。不同生理条件下的细菌，如处于休眠、细胞分裂、老化等各状态的细菌，其质谱图也会发生变化。

检测细菌时，可以将未经处理的细菌直接进样，但这样会产生较少的质谱蜂。为了获得较多的生物标记物，提高细菌检测准确率，需要在检测前对细菌进行处理。Ryzhov等[5]用有机溶剂裂解法、超声波降解法等检测了11种蜡样芽胞杆菌，发现处理后的细菌可以产生较多质谱蜂，而对未处理细菌直接进行检测，发现产生的质谱蜂较少，检测特异性较低。

点样误差的影响：样品厚度不均匀，影响细菌鉴定；杂质以及双层点样时间间隔也将影响采集的质谱峰优劣。一般先点1 μL样品溶液，放干后要马上再点1 μL基质溶液。激光能量的影响：如果因初始能量不均，导致质谱峰变宽，分辨率降低，则可以延时提取激光功率；如果线性检测模式无法鉴别样品，则可以选择反射检测模式。线性模式是离子在飞行管中从一端飞到另一端后被检测到；而反射模式是离子飞到飞行管顶端后，经顶部反射器，将离子又折返回起点，这样离子等于进行了长于线性模式的飞行，因而有利于提高分辨率。基质峰的影响：样品处理时，不仅会溶出试验所需的蛋白质，还会出现其他干扰蛋白质，因此若出现低质量端的大量背景信号，则可以采用偏转法或降压法来抑制基质峰。

本试验主要从微生物培养基、培养状态、菌体前处理等方面进行MALDI-TOF-MS方法探讨，有助于减少该方法操作的盲目性，提高鉴定水平，也有利于今后操作的规范。

1 材料与方法

1.1 试剂

1.1.1 培养基营养肉汤、BP、TTB、SC、MM、Ec肉汤、营养肉汤、肠道增菌液、LST、mTSB、LST-MUG、APW、XLD琼脂、DHL琼脂、BS琼脂、营养琼脂、沙门氏菌显色培养基、HE琼脂、SS琼脂、TSI、副溶血弧菌显色培养基、TCBS琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂：均购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.1.2 其他主要试剂和仪器无水乙醇、氯仿：购自厦门绿茵化玻有限公司，均为分析纯；甲酸、乙腈、三氟乙酸、甲醇、异丙醇，质谱纯：购自Fisher Scientific；α-氰基-4-羟基肉桂酸（alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）、质谱纯：购自BRUKER DALTONICS公司；质量矫正标准品（Bacterial test standard）：购自BRUKER DALTONICS公司。高通量微生物鉴定仪，型号Mtcro flex LRF20：Bruker Daltonics公司生产；高速冷冻离心机，型号Allegra 64R：Beckman公司生产。

1.2 材料与方法

1.2.1 菌株 ETEC c83916：购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；沙门氏菌、副溶血弧菌：为本项目组分离鉴定准确的菌株。

1.2.2 不同培养时间、培养状态、液体培养基的影响将ETEC c83916分别接种两管Ec肉汤、营养肉汤、肠道增菌液、LST、mTSB、LST-MUG培养基，将沙门氏菌分别接种两管营养肉汤、BP、TTB、SC、MM培养基，将副溶血弧菌分别接种两管APW、含3%NaCl的APW、含6%NaCl的APW、含8%NaCl的APW，将其中一管37 ℃静置培养，另一管37 ℃摇床震荡培养，然后分别取培养4、8、10、12、24、48、72 h的菌液1 mL，按照徐淑菲等[3]介绍的方法进行菌液前处理，随后进行MALDI-TOF-MS鉴定。

1.2.3 不同固体培养基的影响将ETEC c83916分别接种麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、营养琼脂、TSI斜面，将沙门氏菌分别接种XLD琼脂、DHL琼脂、BS琼脂、营养琼脂、沙门氏菌显色培养基、HE琼脂、SS琼脂、TSI斜面，将副溶血弧菌分别接种TCBS琼脂、弧菌显色培养基、含NaCl的TSI斜面，37 ℃培养24 h，各取一接种环的菌体置于含生理盐水的离心管中备用。按照徐淑菲等[3]介绍的方法进行菌体前处理，随后进行MALDI-TOF-MS鉴定。

1.2.4 残存培养基的影响将ETEC c83916接种于Ec肉汤、营养肉汤、肠道增菌液、LST、mTSB、LST-MUG培养基，将沙门氏菌接种于营养肉汤、BP、TTB、SC、MM培养基，将副溶血弧菌接种于APW、含3%NaCl的APW、含6%NaCl的APW、含8%NaCl的APW，37 ℃静置培养24 h，每种菌液各取2管，1 mL/管，将其中一管离心后的菌体用生理盐水洗2遍，另外一管离心后弃上清，然后按照徐淑菲等[6]介绍的方法进行后续试验和MALDI-TOF-MS鉴定。

1.2.5 溶出的蛋白放置于-20 ℃的影响将ETEC c83916、沙门氏菌接种营养肉汤，将副溶血弧菌接种APW，37 ℃静置培养24 h。按照徐淑菲等[6]介绍的方法进行菌液前处理，将溶出的蛋白存放于-20 ℃冰箱，隔一段时间进行MALDI-TOF-MS检测。

1.2.6 不同菌量的影响将ETEC c83916、沙门氏菌接种于营养肉汤，37 ℃静置培养24 h，然后进行菌落计数。各取1 mL菌液，对菌体进行10-1～10-6梯度稀释（相当于 102～10-3μL 菌液），将菌体按照徐淑菲等[6]介绍的方法进行前处理和MALDI-TOF-MS鉴定。将ETEC c83916、沙门氏菌接种于营养琼脂平板，将副溶血弧菌接种TCBS，37 ℃培养24 h，挑取单个菌落，用生理盐水洗涤，按照徐淑菲等[6]介绍的方法进行后续步骤和MALDI-TOF-MS鉴定。

1.2.7 重现性试验将ETEC c83916、沙门氏菌、副溶血弧菌按照标准方法制样，同一份样品上清液分别重复点靶3次，自然干燥后加1 μL基质，进行MALDI-TOF-MS分析。

1.2.8 不同前处理的影响将ETEC c83916和沙门氏菌分别接种营养肉汤和营养琼脂平板，将副溶血弧菌分别接种APW和TCBS平板，37 ℃静置培养24 h。本试验将每种细菌各分9组，各组试验操作方法见表1。

表1 分组试验的操作方法

1.2.9 不同上样量的影响将ETEC c83916、沙门氏菌、副溶血弧菌，按照徐淑菲等[6]介绍的方法制样，分别取上清1、2、3、4 μL点靶，各重复3孔。自然干燥后，各加1 μL基质，进行MALDI-TOFMS分析。

2 结果与分析

2.1 不同培养时间、培养状态和液体培养基的影响

综合表2～表4的数据发现，MALDI-TOFMS的鉴定分值并不会随着培养时间的延长而变大，培养时间长短和MALDI-TOF-MS的鉴定分值不成正比，且不影响鉴定结果，但是时间太长会使细菌进入衰亡期，此时菌体易变形或自溶，导致菌体蛋白成分有可能发生改变，因而难以得到确切的质谱分析图谱，从而影响鉴定。震荡培养也不对鉴定分值的提高有任何明显作用。非含盐的培养基对细菌质谱分析的鉴定没有大的差异，但含盐的培养基随着盐分浓度的增高，培养时间需提高，这样才能进行质谱分析鉴定，得到的质谱分值相对于盐浓度低的培养基也低。

建议细菌鉴定培养时间为4～24 h，尽量选择不含盐的培养基。

表2 不同培养时间、培养状态、液体培养基对MALDI-TOF-MS的影响分值（ETEC）

表3 不同培养时间、培养状态、液体培养基对MALDI-TOF-MS的影响分值（沙门氏菌）

表4 不同培养时间、培养状态、液体培养基对MALDI-TOF-MS的影响分值（副溶血弧菌）

2.2 不同固体培养基的影响

ETEC c83916接种麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、营养琼脂和TSI斜面的MALDITOF-MS分值分别为 2.627、2.566、2.439和2.597，沙门氏菌接种XLD琼脂、DHL琼脂、BS琼脂、营养琼脂、沙门氏菌显色培养基、HE琼脂、SS琼脂和TSI斜面的MALDITOF-MS分值分别为 2.172、2.200、2.328、2.214、2.183、2.258、2.434和 2.313，副溶血弧菌接种TCBS琼脂、弧菌显色培养基和含NaCl的TSI斜面的MALDI-TOF-MS分值分别为2.318、2.315和2.522。

固体培养基间的MALDI-TOF-MS鉴定结果一致，但鉴定分值不同。有色培养基培养的菌体用生理盐水洗涤后，有些颜色能够去除，有些无法去除，如用70%的甲酸、乙腈溶解后的上清仍有颜色，这样会影响鉴定分值。

2.3 残存培养基的影响

表5～表7的数据显示，不含盐培养基培养的细菌，如果不经生理盐水洗涤直接进行处理，则对鉴定分值影响很小，不会影响鉴定结果；含盐的培养基培养的细菌，如果不经洗涤直接进行处理，则对鉴定分值影响较大，有时得不到分值超过2的数据，最终影响细菌鉴定。

表5 ETEC残存培养基对MALDI-TOF-MS的影响分值

表6 沙门氏菌残存培养基对MALDI-TOF-MS的影响分值

表7 副溶血弧菌残存培养基对MALDI-TOF-MS的影响分值

2.4 溶出的蛋白放置于-20℃的影响

由表8数据可见，对于不需要盐的培养基培养的细菌，如ETEC、沙门氏菌，溶出的蛋白保存于-20 ℃，长达16周即近4个月的时间，虽然鉴定分值有一定的波动，呈现略微减小的趋势，但都在2以上，而且对结果判定不产生影响；对于嗜盐性细菌，如副溶血弧菌，随着时间的推移，鉴定分值呈现明显的下降趋势，当分值降到2以下，就无法正确做出细菌鉴定。

可见，只要放置于-20 ℃的时间不太长，就能够得到比较准确的鉴定结果。

2.5 菌量的影响

经平板计数，ETEC c83916、沙门氏菌、副溶血弧菌菌落数分别为8.5×108、9.7×108、1.0×109CFU/mL（表9）。

表8 溶出的蛋白放置于-20 ℃对检测结果的影响分值

梯度稀释后菌液的最终MALDI-TOF-MS鉴定结果是一致的，但随着菌量的减少，分值会减弱，10-4（0.1 μL菌液）稀释后尤其明显，即使稀释到10-6，也不影响最终结果判定，但细菌的蛋白质组指纹图谱采集越来越难。综合来说，0.1 μL菌液也可以作为最低菌量的考量，ETEC c83916、49#沙门氏菌、3#副溶血弧菌的最低检出量分别为8.5×104、9.7×104、1.0×105CFU。

表9 菌量对MALDI-TOF-MS结果的影响分值

ETEC c83916和沙门氏菌接种于营养琼脂平板，副溶血弧菌接种TCBS，挑取的单个菌落MALDI-TOF-MS鉴定分值分别为2.203、2.289和2.252。固体单菌落的MALDI-TOF-MS分值较液体培养的低，结果不如液体培养更可靠。

2.6 重现性

表10显示的是3种菌的MALDI-TOF-MS重复性试验数据，1～9的编号与电泳图谱（图1）、指纹图谱（图2）编号一一对应。ETEC c83916、沙门氏菌、副溶血弧菌3个重复靶孔的质谱分值最高分别为2.555、2.532、2.469，2.314、2.289、2.245，2.284、2.345、2.391，相同菌种的质谱分值很接近，最高都在2以上，且排在“Detected Species”前几位或者说分值较高的都是同一菌种，均可以进行菌种判定。电泳图谱和指纹图谱显示，相同菌、相同处理方式、不同靶孔的重现性很高，特征性蛋白条带和蛋白质谱峰几乎完全一样，每个样品不必像其他一些方法那样需要设置重复。

表10 MALDI-TOF-MS结果的重现性最高分值

图1 MALDI-TOF-MS电泳图谱

图2 MALDI-TOF-MS指纹图谱

2.7 不同前处理的影响

除了按照标准化前处理程序处理细菌外，还有几种菌体前处理方法也能够得到良好的鉴定结果（表11）：第2～5组菌液，经生理盐水洗涤后，直接加不同量的ddH2O制成混悬液后进行点靶鉴定，即能得到良好的鉴定结果，1 mL菌液用200 μL左右的ddH2O溶解较佳（第3组）；第8组菌液，经生理盐水洗涤后，直接加50 μL 70%甲酸和50 μL乙腈，离心后上清点靶，可以得到较为理想的鉴定分值；第6、7组菌体，经超声波或冻融裂解后，得到的分值偏离标准组太大，有的细菌鉴定分值低于2，不可采用；第9组固体培养基的菌落，没有经过任何前处理，直接点靶，所得鉴定分值偏离标准组太大，不建议采用。

表11 不同前处理对MALDI-TOF-MS结果的影响分值

2.8 不同上样量的影响

不同上样量对结果影响不大，只要样品均匀，就能得到m/z一致的峰（表12）。

3 讨论

3.1 公共卫生安全问题

肠毒性大肠埃希杆菌携带不耐热肠毒素（Heat labile toxin，LT）和耐热肠毒素（Heat stable toxin，ST），可引起恶心、腹痛、低热，以及急性发作的水样腹泻，是最为常见的一种致泻性大肠埃希菌[7]。其定居于小肠表面，不损坏也不侵入肠黏膜上皮细胞，只通过产生肠毒素而引起分泌性腹泻。近来在人类霍乱病人大便中，新发现一组致腹泻性大肠埃希杆菌，它是发达国家“旅游者腹泻”的主要病原之一，是“成人霍乱综合征”的常见原因，也是小儿腹泻的重要病原，由其引起的发病率仅次于轮状病毒。

沙门氏菌是肠杆菌科的一种具有重要公共卫生意义的常见人兽共患病原菌，广泛分布于自然界，目前在全世界已分离出2 523个血清型，不仅能导致鸡白痢、鸡伤寒、副伤寒、仔猪副伤寒、流产等多种动物疾病，还能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎、感染性腹泻和食物中毒等疾病。在世界各地的食物中毒事件中，沙门氏菌引起的中毒病例均占首位或第二位[8]。

副溶血性弧菌是引起食物中毒较为常见的一种病原，是当今导致食物中毒最主要的细菌，由其引起的食物中毒事件近年来呈上升势头。生活中常常由于厨房工作人员卫生意识差、食物生熟不分，致使海水产品中污染的弧菌引起学校、幼儿园发生群体性食物中毒，个别可呈败血症表现。由副溶血性弧菌引起的疾病多发生于夏秋季节，重点是沿海地区，常造成集体发病，近年来沿海地区的发病数量也有增多趋势[9]。

3.2 不同培养基、培养时间、培养状态对鉴定结果不会产生明显影响

细菌新陈代谢包括细菌细胞的生物合成、能量供给、运动及化学反应表现的各种活性。其代谢过程按功能分为物质摄取、生物合成、聚合作用及组装。不同的液体培养基或者固体培养基供细菌摄取物质，提供营养成分，并不改变细菌的遗传性状。嗜盐、有色或者显色培养基是为了使细菌更好地生长和更准确地鉴别，震荡培养也是为了加快细菌生长繁殖，不影响细菌菌体内蛋白质的合成及成分，因此对MALDI-TOF-MS鉴定结果没有影响。一般的培养基（主要指液体），离心后只要去除上清很彻底，菌体就无培养基颜色，用70%甲酸、乙腈溶解菌体后的上清液也不会留有培养基的颜色，因而就不会影响后续鉴定。但若用70%甲酸、乙腈溶解菌体后的上清仍有培养基颜色，则会影响鉴定分值。

细菌的生长繁殖分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期，对数期的病原菌致病力最强，其形态、染色特性及生理活性均较典型，对抗菌药物等的作用较为敏感。稳定期，因营养消耗、代谢产物蓄积等，细菌繁殖速度会下降，死亡数逐步上升，这样可使活菌数与死菌数保持大致平衡。但稳定期的细菌形态及生理形状常有改变，革兰氏阳性菌此时可染成阴性，毒素等代谢产物大多在此时产生。本试验中，虽然MALDI-TOF-MS的鉴定结果没有随培养时间延长而改变，但当菌体进入衰亡期后，菌体可能会变形或自溶，菌体蛋白成分也可能发生改变，而且此时细菌黏稠度增大，不易离心得到菌体，所以建议优先选择新鲜培养的菌液，以24 h内的细菌为佳。

Arnold等[4]认为，在进行细菌检测时，使细菌培养性状保持稳定十分必要。建议最好采用新鲜培养的菌液，菌体离心后用生理盐水洗涤，并尽可能完全去除培养基成分。

3.3 点样厚度对鉴定结果无大的影响，均匀性对结果影响较大

基质、溶剂、盐（金属离子）和样品制备方法的选择是MALDI分析高聚物成败的关键。最优化的条件是，使样品分子和基质均匀形成共结晶，基质吸收激光的能量，并将能量传递给样品，帮助样品离子化。本试验证实，样品厚度对结果判定没有实质性影响，但若样品厚度不均一，则易造成激光能量不均一，样品离子化程度或者时间就会不一致，从而导致蛋白质质谱峰偏移（图3），影响判定。