山东省莱西市奶牛结核病流行率及风险因素分析

刘爱玲，马清霞，韩 雪，沈朝建，康京丽，张 毅，王幼明

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2. 青岛市动物疫病预防与控制中心，山东青岛 266071；3. 北京维通利华实验动物技术有限公司，北京 100107）

牛结核病（Bovine tuberculosis，TB）是由牛结核分枝杆菌引起的一种人兽共患慢性传染病，可侵害多种动物，家畜中奶牛最易感染[1]。牛结核病，尤其是奶牛结核病，不但影响奶牛生产力，而且威胁人的身体健康，因此加强结核病防控具有重要的公共卫生意义。

牛结核病潜伏期长短不一，自然感染的病例潜伏期为16～45 d，甚至在几个月以上或数年。关于结核病的风险因素，有研究表明野生动物是牛结核病的重要风险因素，其种类因地区不同而异，如在非洲是水牛，在欧洲是野猪和獾，在新西兰是负鼠[2-3]。鹿也是牛结核病的潜在感染源[4]。家养动物主要通过野生动物感染[5]。野生动物这一风险因素的存在，是牛结核病难易根除的一个主要原因，宿主的广泛性和疾病控制的限制性使得牛结核病作为人兽共患病，备受公共卫生方面的关注[6]。Morris等[4]研究表明，虽然牛结核分枝杆菌宿主广泛，但近些年主要感染牛和人。牛结核病可以通过空气传播[7]，而不易通过污染的饲料和牧草传播。因为在现实条件下，污染物中的细菌存活时间相对短，动物通过消化道途径不易暴露至感染剂量，但可以通过口咽部黏膜感染[4]。有研究将牛结核病的风险因素分为国家、群体和动物水平：在群体水平方面，风险因素包括人和动物的牛结核病史、群体大小、牛场类型以及管理方面因素（养殖密度、粪便、饲料、粪-口传播途径等），还包括诊断试验效果、皮试检测频率、人工和兽医服务质量、扑杀率、其他家养动物、野生动物、存在分枝杆菌的环境、天气变化，以及牛的引进、调运等[8]。

莱西市是山东省主要奶牛生产基地，拥有以“雀巢”“迎春乐”“新希望”为龙头的奶业产业链[9]。本研究以莱西市所有奶牛为目标群，采用横断面研究方法，通过实验室检测估计莱西市奶牛结核病的群流行率和个体流行率，采用病例对照研究方法，分析奶牛结核病传播的可能风险因素，并建立回归模型，以期为奶牛结核病防控策略改进提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 目标群及抽样策略

2016年莱西市共有548个奶牛养殖场（户），存栏34 962头奶牛。本研究以莱西市所有奶牛养殖场（户）为目标群，按照养殖规模不同，采取不同的抽样策略。存栏量30头以上的场（户）259个，全部检测，场（户）内随机抽样30头检测；存栏量30头以下的场（户）289个，采用随机抽样的方法，按照置信区间95.0%、预期流行率15.0%、可接受误差5.0%，计算出的抽样场（户）数为117个，场（户）内奶牛全部检测。

2.2 样本收集和实验室检测

按照抽样策略，采集3月龄以上、未怀孕的奶牛血液样本，分离血清，按照牛型结核分枝杆菌抗体检测试剂盒（IDEXXM.bovis）说明进行检测。对ELISA抗体检测阳性场（户）内所有奶牛，采用ELISA方法和单纯皮内变态反应（SICT）垂直试验进行检测[10-12]。

2.3 病例定义

采用垂直试验方法，检测结果为阳性的动物为阳性个体。

采用ELISA方法，至少检出3个阳性样本的奶牛场或养殖户为阳性群。

所有阳性群均为病例，在病例所在同一自然村内，选择相同养殖规模的阴性群为对照。对照数是病例数的4倍。

2.4 数据来源与分析

结合实验室检测结果，以场群为单位，采用病例对照研究方法，进行问卷调查，获取奶牛卫生状况及风险因素相关数据。

使用Microsoft Excel 2007软件进行数据录入、整理及部分图表绘制；使用Epi InfoTM7软件进行四格表和Logistic 回归分析，并建立回归模型；用IBM SPSS statistics 22对模型预测概率进行检验。

2.5 敏感性和特异性计算

根据采用IDEXX 试剂盒检测牛结核病的有关研究[13]，设定ELISA试验检测敏感性Se1=63.0%，特异性Sp1=98.0%。根据群敏感性公式 HSe=1-(1-p)n= 1-{1-[p×Se+(1-p)(1-Sp)]}n和群特异性公式HSp=Spn，获得检测群敏感性和群特异性。式中，p是场内预估流行率（15.0%），n为场内抽样数量。

根据结核病检测方法有关研究[11]，设定SICT试验敏感性Se2=80.0%，特异性Sp2=96.0%，根据公式Se3=Se1×Se2，Sp3=1-(1-Sp1)(1-Sp2)，计算垂直试验敏感性 Se3=50.4%，特异性Sp3=99.9%。

2.6 流行率计算

表观流行率（AP）=检测阳性数量/检测总数；

真实流行率（TP）=(AP+Sp-1) / (Se+Sp-1)；

95%置信区间：95%CI=p±式中，p为真实流行率，Z为标准正态分布中概率为0.05所对应的值，n为抽样数量。

2 结果

2.1 流行率估计

2.1.1 群流行率 根据群敏感性和特异性公式，按照场内抽样30、场内预估流行率15.0%，将至少检测到3个阳性动物的群定义为阳性群，群敏感性（HSe）=66.5%，群特异性（HSp）=97.8%（表1）。本次共调查了548个场，检测了其中376个，用ELISA方法共检测到26个阳性场；检测了存栏量在30头以上的场（户）259个，检出阳性场（户）16个，检测30头以下场（户）117个，检出阳性场（户）10个。根据检测结果，计算群表观流行率（AP）=6.9%，根据公式TP =(AP+HSp-1)/(HSe+HSp-1)，得到真实流行率（TP）=7.3%（95%CI：4.7%～10.0%），存栏30头以下场（户）的群流行率高于存栏30以上场（户），详见表2。

表1 不同阳性数的群敏感性和特异性计算 单位：%

表2 奶牛结核病群流行率测量结果

2.1.2 个体流行率 本次调查共检测样品8 880份，检出阳性93份，其中检测存栏量30头以上场（户）样品7 770份，检出阳性81份，检测存栏30头以下场（户）样品1 110份，检出阳性12份。根据公式计算得到，莱西市奶牛结核病个体表观流行率（AP）=1.0%，真实流行率（TP）=1.9%（95%CI：1.6%～2.2%）。存栏30头以下和30头以上场（户）间个体流行率无显著差异（P＞0.05），详见表3。

表3 奶牛结核病个体流行率测量结果

3.2 风险因素分析

3.2.1 单因素分析 本研究采用病例对照方法，对220个场（户）进行了问卷调查，共涉及11个场（户）间奶牛结核病传播相关影响因素。单因素分析结果（表4）显示，“养殖环境、是否隔离、产犊场地、接生人员、挤奶方式、粪便处理方式和诊治人员”7个变量具有统计学意义（P＜0.1）。经Mantel-Haenszel分层分析发现，在“挤奶方式”分层条件下，“是否隔离”变量未调整前，OR=4.37（95%CI：1.95～9.80，P＜0.001），调整后，OR=5.18（95%CI：1.80～14.9，P＜0.001），表明“挤奶方式”对“是否隔离”有一定影响，是可能的混杂因素。

3.2.2 Logistic回归分析 通过Logistic回归，对以上7个有统计学意义的因素进行分析，多因素分析发现，“养殖环境、是否隔离、产犊场地、接生人员”等因素具有统计学意义。通过似然比检验发现，“是否隔离和挤奶方式”存在交互作用（LD=243.6427-234.9130=8.73，DF=1，P=0.007）。 将混杂因素和交互作用因素放入模型，Logistic回归模型为Y= -3.984+1.268X1+4.284X2+1.105X3+1.581X4+0.612X5-3.810X2X5，相关参数见表5。经Hosmer-Lemeshow检验，P=0.05，似然比检验-2lnL=196.394，模型拟合度较好。用SPSS软件绘制ROC曲线检验模型准确性，ROC曲线下面 积 为 0.808（95%CI：0.736～0.880，SE=0.037，P＜0.001），表明该模型预测概率较好（图1）。

表4 影响因素的单因素分析

图1 回归模型的ROC曲线

表5 Logistic回归分析结果

4 讨论

莱西市是奶牛养殖示范地区，养殖模式分为规模场、养殖小区和奶牛集中村3种，规模化程度较高，生物安全措施较好。往年监测的奶牛结核病场群流行率和个体流行率均较低。本研究对莱西市69%的奶牛养殖场（户）进行了不同方式的抽样检测，对于养殖量30头奶牛以上的场（户）全检，场内随机抽样30头，30头以下场（户）的场内牛全检。虽然对于养殖量大的场（户）抽样量不足，但因检测覆盖面较广，检测结果仍具有代表性，可在一定程度上反映该地区奶牛结核病的真实流行情况。

虽然目前SICT仍是牛结核病现场检测的国际通用方法，但由于敏感性较低，其并不是最佳方法[13]。IFN-γ检测方法也被广泛应于牛结核病检测，但是试验的特异性和敏感性不是最好。诊断试验方法的缺乏也是导致牛结核病重复出现的一个重要原因[14]。本研究采用ELISA方法进行场群流行率估算。由于ELISA试验敏感性较低，仅为63.0%，如果以发现1个阳性病例为依据定义阳性场，则阳性预测值为0，不能发现阳性病例，因此本研究以发现3个阳性病例为依据定义阳性场群，计算检测的阳性预测值为70.5%，阴性预测值为97.4%，试验敏感性为66.5%，特异性为97.8%，可以估算本地区奶牛结核群真实流行率。对于个体流行率估算，本研究采用ELISA和SCIT垂直试验的方法，试验特异性可达99.9%，阳性预测值为99.4%，假阳性非常少。但由于试验敏感性仅为50.4%，个体表观流行率和真实流行率分别为1.0% 和1.9%，两者差别较大[15]。

莱西市的养殖类型既有封闭式，也有开放式。而封闭式管理多为规模场和奶牛小区，开放式多为奶牛集中村。因养殖类型与养殖环境具有相似性，故本研究仅将养殖环境列入影响因素进行分析。考虑到本地区特殊的养殖环境，如果同一养殖小区或集中村包含多个养殖户，在进行流行率计算时将其定义为一个病例，但在进行病例对照研究时，如果同一养殖小区或集中村出现多个病例，则视为多个病例。

本研究共对220个场（户）进行了问卷调查，其中病例63个、对照157个。病例和对照组由于养殖类型的关系，存在很多相同的养殖方式和管理措施，对影响因素分析结果可能存在一定的偏倚。对于奶牛结核病相关影响因素的选择，胎儿及流产物的处理方式本应列入影响因素，但通过调查发现，该地区对此均采取焚烧或掩埋的方式处理，故不作为该地区奶牛结核病传播影响因素。

对所选择的11个影响因素进行分析发现，“是否隔离”与“挤奶方式”之间存在交互作用，且“挤奶方式”可能影响隔离措施。虽然这两个因素在生物学上看似无关联，但考虑到这两个因素可能均与经济相关，且具有统计学意义，故本研究将交互和混杂因素均列入模型中。对于是否将交互作用加入模型中，通过建立不同模型进行比较，发现加入交互作用后，似然比检验差异极显 著（LR=204.7843-196.3945=8.38，DF=1，P＜0.005）。将加入交互作用的模型进行拟合度检验，发现P=0.05，表明该模型可以接受。

5 结论

采用ELISA血清学检测，估计莱西市奶牛结核病的群真实流行率为7.3%（95%CI：4.7%～10.0%）；ELISA和SICT垂直试验检测，估计莱西市奶牛结核病个体真实流行率为1.9%（95%CI：1.6%～2.2%）。病例对照研究发现，“规模场、无隔离措施、无产犊场地、外来人员接生”等为莱西市奶牛结核病传播相关风险因素。本研究可为本地区奶牛结核病防控提供依据。