NH4+双阶段发酵控制谷氨酸工艺研究

刘景阳，余子辰，徐庆阳,2,3*

(1.天津科技大学 生物工程学院，天津 300457；2.天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室，天津 300457；3.代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津 300457)

谷氨酸是生物体中蛋白质的主要构成成分之一，也是参与机体氮代谢的基本氨基酸之一，在生命代谢活动中发挥着重要作用[1]。因此，L-谷氨酸被广泛应用到食品、医药、化工、化妆品、饲料等行业中，已经成为世界上应用范围较广的氨基酸产品，年产量接近200万吨，产值超过200亿，市场前景广阔，潜力巨大[2-3]。但是，相较于国外的发酵技术，我国的谷氨酸发酵技术产酸率仅在15%左右，糖酸转化率在64%左右，与国际领先水平仍有较大差距。究其原因，主要是我国谷氨酸发酵行业发酵工艺简陋，发酵过程调控粗放，进而导致菌体活力不足，产酸能力弱。因此，采用合适的发酵控制工艺成为提高谷氨酸产量的有效途径[4-5]。

NH4+在微生物发酵过程中常被用作氮源，在细胞内参与辅因子、氨基酸、蛋白质、核酸等含氮化合物的合成，在菌体生长代谢中扮演着重要角色[6]。郑梦杰等[7]在研究铵离子抑制 avermectin 生物合成的机理时发现，NH4+能直接或间接地影响菌体代谢过程中各种酶的活力，导致菌体内部TCA循环加强，丙酮酸含量降低，同时由于能量代谢加快，ATP大量生成，过量的ATP经反馈后会抑制糖酵解过程中的酶，从而降低糖酵解效率。冯宁等[8]在探究NH4+浓度对黄色短杆菌XV0505发酵生产L-缬氨酸的影响时，发现NH4+浓度过高会抑制菌体生长，使得菌体量较少，从而影响产酸期产量，另外，发酵前期高浓度的NH4+会产生一定程度的阻遏效应，使发酵产酸阶段对于NH4+的同化作用减弱，降低产酸。同样，对于谷氨酸发酵而言，合适的NH4+浓度对谷氨酸发酵过程中菌体活力和菌体产酸能力尤为重要，在以菌体生长为主的阶段，过高的NH4+浓度会抑制菌体生长，降低菌体活力；在以产酸为主的阶段，NH4+浓度过低会使得α-酮戊二酸不能被还原成氨基酸，无法生成谷氨酸，造成α-酮戊二酸积累[9-10]。

目前，谷氨酸的生产方法主要有化学合成法、酶解法和微生物发酵法，其中由于微生物发酵法原料成本低、反应条件温和、易于扩大生产等优点，逐渐成为L-谷氨酸行业普遍采用的大规模L-谷氨酸生产方法[11-13]。发酵法生产谷氨酸时通常需要流加氨水，一方面用于维持适宜的发酵环境pH，保证菌体的正常生长；另一方面提供谷氨酸发酵所需的NH4+，保证菌体的产酸性能[14]。但是，由于发酵过程中用于调节pH的氨水中的NH4+并不能被全部用来生产谷氨酸，NH4+过量积累，最终高浓度的NH4+会导致菌体活力和产酸性能下降，发酵上表现为菌体衰老死亡，产酸量和糖酸转化率降低[15-16]。

针对上述问题，本研究以生物素亚适量型菌株黄色短杆菌GDK-9为供试菌株，分析NH4+对谷氨酸生产菌株的生长特性和生产性能的影响，同时构建L-谷氨酸生物合成的代谢网络模型[17]，对其进行代谢流分析，针对发酵生产谷氨酸的不同阶段，探究NH4+双阶段控制工艺，从而提高菌体活力和L-谷氨酸产量。

1 材料与方法

1.1 菌种

L-谷氨酸生产菌：生物素亚适量型菌株黄色短杆菌GDK-9，天津科技大学代谢工程研究室保藏。

1.2 培养基

1.2.1 活化斜面培养基

葡萄糖2 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO4·3H2O 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，琼脂粉25 g/L。

1.2.2 种子培养基

葡萄糖35 g/L，玉米浆干粉15 g/L，氯化胆碱0.1 g/L，丁二酸1 g/L，豆粕水解液22 mL/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，蛋氨酸0.5 g/L，FeSO4·7H2O 5 mg/L，VB50.5 mg/L，MnSO4·H2O 5 mg/L，VB10.5 mg/L，VB30.5 mg/L，K2HPO4·3H2O 3 g/L，VB120.5 mg/L，甜菜碱0.1 g/L。

1.2.3 发酵培养基

MnSO4·H2O 10 mg/L，氯化胆碱0.1 g/L，MgSO4·7H2O 1.8 g/L，KCl 1.8 g/L，豆粕水解液15 mL/L，VB30.5 mg/L，FeSO4·7H2O 5 mg/L，Na2HPO4·12H2O 3.5 g/L，VB10.5 mg/L，VB50.5 mg/L，VB120.5 mg/L，糖蜜1.2 g/L，玉米浆干粉2.5 g/L，甜菜碱0.1 g/L。

1.3 主要仪器

LDZH-100KBS型全自动立式蒸汽灭菌器 天津博鑫生物科技有限公司；5 L自动控制发酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司；SBA-40E生物传感分析仪 山东省科学院生物研究所;Agilent 1200高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司；奥林巴斯高压蒸汽发生器 上海奉贤协新机电厂；752分光光度计 上海分析仪器厂；Olympus生物显微镜 日本Olympus株式会社。

1.4 培养方法

1.4.1 菌种活化

使用接种环从保藏在-80 ℃的甘油管中蘸取2～3环菌液，然后均匀接种于2支一代斜面上，在32 ℃培养箱中持续培养12 h，之后从培养好的一代斜面中取1环菌体接种于二代斜面上，在32 ℃培养箱中持续培养12 h。

1.4.2 一级种子培养

将活化好的菌种斜面分别接种到3个1 L圆底烧瓶中，每个烧瓶中含有100 mL的种子培养基，然后将其置于32 ℃，220 r/min的摇床上，连续培养6～8 h。

1.4.3 二级种子培养

将培养好的一级种子通过发酵罐进样口接种到含有种子培养基的5 L发酵罐中，通过流加氨水控制pH在7.0左右，温度34 ℃，溶氧维持在30%～50%。

1.4.4 发酵培养

当OD600达到15左右时，按20%的接种量接入含有发酵培养基的5 L发酵罐中。发酵过程中通过流加调节液(用于调节pH)，将pH控制在7.0左右，通过控制转速和通风量将溶氧稳定在30%～50%。初始发酵温度为36 ℃，发酵时间为30～32 h。

1.5 检测方法

1.5.1 pH的测定

采用发酵罐自带的梅特勒pH电极进行测定，用pH 6.4～8.0的精密pH试纸辅助测定。

1.5.2 残糖含量的检测

每隔2 h取样，离心，取上清液，将上清液稀释100倍，用SBA-40E生物传感分析仪检测残糖含量。

1.5.3 菌体量的检测

每隔2 h取样，分别稀释10，20，50，100倍，用紫外可见分光光度计测量 OD600。

菌体生物量=吸光值 OD600×稀释倍数。

注：吸光值范围在0.2～0.8，超过量程后需换下一个稀释倍数。

1.5.4 有机酸和氨基酸的测定

使用高效液相色谱分析仪进行有机酸测定，首先，取1 mL的发酵液置于1.5 mL的离心管中，12000 r/min离心5 min，取其上清液并进行适当倍数稀释，然后过0.22 μm微孔滤膜，最后采用液相色谱分析仪进行含量检测；色谱柱条件：色谱柱型号为Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm，8 μm)，用0.04 mol/L硫酸缓冲液洗脱，柱温32 ℃，流速0.4 mL/min，检测波长为210 nm。

发酵液中氨基酸(副产物)含量采用氨基酸分析仪进行检测，发酵液的预处理方式同上述有机酸测定，稀释适当倍数后，过0.22 μm微孔滤膜，最后使用氨基酸分析仪进行定量检测；色谱条件：LCAK06/Na型色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，体积分数为50%的乙腈溶液缓冲液A和4.1 g/L的乙酸钠缓冲液B同时洗脱，柱温58 ℃，流速0.50 mL/min，检测波长分别为570 nm和440 nm。

2 结果与讨论

2.1 L-谷氨酸发酵过程分析

在5 L自控发酵罐中进行L-谷氨酸补料分批发酵，在发酵过程中每2 h测定菌体量(OD600)、L-谷氨酸产量和NH4+浓度，绘制L-谷氨酸发酵过程曲线，结果见图1。

图1 L-谷氨酸发酵过程曲线

由图1可知，NH4+浓度在整个发酵过程中呈现持续上升的趋势，其中有2个增长趋势明显加快的时间点，分别为4 h和20 h。在4 h时，由于菌体量快速上升，菌体开始转型，导致L-谷氨酸分泌，因而需要流加氨水以平衡发酵环境的pH,发酵液中NH4+浓度明显上升。到了20 h时，NH4+浓度已经超过了500 mmol/L，高浓度的NH4+严重影响菌体的生长，菌体活力开始下降，菌体量出现下降趋势，L-谷氨酸生产速率也趋于平缓，同时由于菌体活力的下降，菌体代谢流异常，转而生产副产物乳酸、丙氨酸，这些副产物同样需要氨水来平衡发酵液中的pH，最终导致NH4+补充量大于消耗量，进而使得NH4+在发酵液中继续积累。

由此可见，NH4+浓度的控制主要有两个阶段：第一阶段为发酵前、中期，要尽可能地维持NH4+浓度使其既能保证菌体快速生长，又不影响菌体产酸；第二阶段为发酵后期，由于长时间的发酵，菌体活力开始下降，如何避免高浓度NH4+对菌体的进一步毒害，从而保证菌体产酸速率成为重中之重。

2.2 L-谷氨酸发酵前、中期NH4+发酵控制对发酵结果的影响

本研究采用NaOH和氨水混合调节pH的方法，取代了传统发酵中的全氨水调节，通过调节配比从而控制发酵液中NH4+的浓度。对于发酵前、中期的NH4+控制，本研究在发酵开始时分别采用NaOH∶氨水的摩尔比例为1∶3(A)、1∶5(B)、1∶7(C)、1∶9(D)、全氨水(E)的调节液代替氨水调节发酵液的pH，通过测定发酵过程中NH4+浓度、OD600和L-谷氨酸产量，明确了不同配比对菌体生长及产酸情况的影响，从而确定最佳混合比例，结果见图2。

图2 发酵前、中期NH4+控制的发酵过程曲线

E为全氨水调节，即基础发酵，其发酵液中NH4+浓度增长速度最快，最大NH4+浓度为679 mmol/L，而随着氨水比例的下降，NH4+的增长趋缓，A、B、C、D的最终NH4+浓度分别为101，203，486，590 mmol/L，较E分别降低了85.1%、70.1%、28.4%、13.1%。

另外，随着氨水比例的下降，菌体量OD600的值逐渐升高，E的最大菌体量为51，最终菌体量为38，菌体量下降幅度为13，而A、B、C、D的最大菌体量分别为70，66，61，57，较E分别提高了37.3%、29.4%、19.6%、11.8%，最终菌体量分别为64，59，52，47，菌体量下降幅度分别为6，7，9，10，较E分别降低了53.8%、46.2%、30.7%、23.1%。对于L-谷氨酸来说，当NH4+下降时，L-谷氨酸产量表现为先升高后下降的趋势，E的L-谷氨酸产量为153 g/L，A、B、C、D的L-谷氨酸产量分别为62，129，162，156 g/L，其中A、B较E分别下降了59.5%和17.3%，C、D较E分别提高了5.8%和2.0%。综合结果来看，在发酵前、中期选择NaOH和氨水混合比例为1∶7的调节液替代氨水，效果最好，其最大菌体量为61，最终菌体量为52，L-谷氨酸产量为162 g/L。

从上述结果分析可以看出，NH4+浓度对L-谷氨酸发酵产酸具有十分重要的影响：氨基酸中所需要的氮素来源是NH4+的同化，丙酮酸、α-酮戊二酸是L-谷氨酸代谢中的重要物质，在低NH4+环境下，丙酮酸和α-酮戊二酸这些参与铵同化的有机酸不能被利用，从而被排出细胞，影响L-谷氨酸的生产；当NH4+浓度过高时，在发酵初期菌体活力不足，菌体增长速率和最大菌体量都较低，当菌体增长速率不足时，会导致菌体间竞争生物素能力下降，进而使得菌体转型不充分，影响菌体产酸，同时，过高的NH4+浓度在发酵后期会导致菌体衰老得更早，甚至自溶裂解，增加发酵液的黏度，影响氧的传递，对最终的L-谷氨酸产量以及后续的提取造成不良后果。

2.3 L-谷氨酸发酵后期NH4+发酵控制对发酵结果的影响

通过对发酵前、中期的NH4+发酵控制可以发现，仅在前、中期对NH4+浓度控制是不够的，发酵后期NH4+依然处于较高浓度且有一直增长的趋势，这表明L-谷氨酸发酵前、中期与发酵后期对于NH4+的需求并不一样，为了保证L-谷氨酸发酵过程中NH4+浓度始终处于较为适宜的情况，为此本研究在L-谷氨酸发酵前、中期NH4+发酵控制的基础上，对发酵后期的NH4+浓度进行控制优化，在发酵18 h开始采用NaOH和氨水混合比例(摩尔浓度)为1∶1(A)、1∶3(B)、1∶5(C)、1∶7(D)，通过每2 h测定发酵液中的NH4+浓度、OD600和L-谷氨酸产量，绘制过程曲线，见图3。

图3 发酵后期NH4+控制的发酵过程曲线

由图3可知，D为NaOH和氨水的混合比例(摩尔浓度)1∶7，即全程1∶7调节发酵，D的NH4+浓度曲线处于持续增长趋势，最终NH4+浓度为486 mmol/L。C的NH4+浓度曲线与D的NH4+浓度曲线趋势相同，但相较于D来说较为平缓，24 h之后NH4+浓度又快速上升，最终NH4+浓度为400 mmol/L。A与B的NH4+浓度曲线在替换调节液后，NH4+浓度先是出现了下降趋势，而后趋于平稳，且B相较于A较为平缓，A和B的最终NH4+浓度分别为72 mmol/L和121 mmol/L，表明在发酵后期NH4+浓度维持在100 mmol/L左右即可满足菌体对于NH4+的需求。

由图3中的菌体生长曲线和L-谷氨酸产量曲线可知，D的最大菌体量为62.4，最终菌体量为52.1，菌体量下降幅度为10.3，L-谷氨酸产量为158 g/L。A、B、C的最大菌体量基本相同，分别为63，63，62.1，最终菌体量分别为60.2，58，54.4，菌体量下降幅度分别为2.8，5，7.7，较D降低了72.8%、51.5%、25.2%。A、B、C的L-谷氨酸产量分别为159，167，161 g/L，较D分别提高了0.6%、5.7%、1.9%。

综上所述，在发酵后期，发酵液中NH4+浓度越高，菌体活力下降越严重，表现为菌体产酸速率和产酸量下降，菌体衰老自溶，同时由于菌体自溶释放的菌体碎片、菌体蛋白、内毒素等物质会进一步降低菌体活力，降低氧的传递效率，影响菌体的发酵性能，造成恶性循环；当发酵液中NH4+浓度过低时，NH4+对菌体生长的抑制作用解除，保证了菌体活力，但过少的NH4+又成为菌体产酸的限制因素，最终依然会导致产酸速率和产酸量的降低。因此，发酵后期合适的NH4+浓度对菌体的生长和生产性能有很大影响，通过上述结果分析，最终决定在发酵后期选择NaOH和氨水的摩尔混合比例为1∶3的调节液作为替代，既保证菌体活力又不会成为产酸的限制因素，能够提高L-谷氨酸的产量。

2.4 L-谷氨酸发酵过程中转换时间对双阶段NH4+控制发酵结果的影响

为了探究双阶段NH4+控制的转换时间对L-谷氨酸发酵结果的影响，本研究选择在16 h(A)、19 h(B)、21 h(C)、24 h(D)进行两个阶段调节液的替换，通过对整个发酵过程中NH4+浓度、OD600、L-谷氨酸产量进行测定，明确不同转换时间对双阶段NH4+浓度控制发酵结果的影响，从而确定最佳转换时间，结果见图4。

图4 转换时间对双阶段NH4+控制发酵结果的影响

由图4可知，A和B的NH4+浓度曲线趋势大致相同，二者在转换完成后NH4+浓度快速下降，而后趋于平缓，最终NH4+浓度分别维持在50.4 mmol/L和120.1 mmol/L，C和D的NH4+浓度曲线逐渐上升，且C的曲线较D来说较为平缓，最终NH4+浓度分别为394 mmol/L和491 mmol/L。A、B、C、D 4种情况最大菌体量大致相同，分别为63.5，62.2，63，62.6，最终菌体量随着转换时间的推后逐渐降低，分别为60.8，59，58，56，下降幅度分别为2.7，3.2，5，6.6，L-谷氨酸最终产量分别为160，170，163，155 g/L。

通过分析发现，在16 h和19 h转换调节液后，由于此时L-谷氨酸生产速度较快，因此转换后NH4+被快速消耗，NH4+浓度逐渐降低，适宜的NH4+浓度保证了菌体活力，L-谷氨酸生产速率得以维持，之后趋于平缓。原因是发酵时间过长致使菌体衰老，L-谷氨酸生产速率下降，NH4+浓度维持在该水平，但16 h时，由于过早进行替换导致NH4+浓度过低，不能满足菌体生产L-谷氨酸，因此16 h相较于19 h，最终的L-谷氨酸产量较低。在21 h和24 h进行转换时，由于此时菌体活力已经下降，菌体量开始下降，菌体裂解死亡，副产物与内毒素积累，使得此时即使转换调节液，补充的NH4+也无法被大量消耗，因而发酵液中NH4+浓度快速上升，L-谷氨酸产酸速率下降，影响最终的L-谷氨酸产量。综合上述结果来看，最终选择在19 h进行调节液的替换，此时进行替换既不影响前、中期L-谷氨酸的生产，同时还能保证发酵后期的菌体活力以及菌体的产酸能力。

2.5 最优条件下的发酵结果验证

通过对上述实验的论证分析可以得出，在采用双阶段NH4+发酵控制进行L-谷氨酸发酵实验时，最佳发酵条件为在发酵开始时采用NaOH和氨水摩尔混合比例为1∶7的调节液代替纯氨水进行pH的调节，在发酵19 h时采用NaOH和氨水摩尔混合比例为1∶3的调节液代替1∶7的调节液进行pH的调节，在此优化条件下对双阶段NH4+发酵控制策略进行多批次发酵结果验证，结果见图5和表1。

表1 两种发酵方式对糖酸转化率的影响

图5 最优条件下的发酵过程曲线

在基础发酵的NH4+浓度过程曲线中，NH4+浓度呈现持续上升趋势，且上升速度较快，最终的NH4+浓度为678 mmol/L，而采用了双阶段NH4+发酵控制策略后，在发酵前、中期，发酵液中NH4+浓度快速上升，而后当L-谷氨酸产酸速率稳定后，NH4+浓度基本维持在300 mmol/L左右，而在发酵后期，由于调节液中NH4+浓度降低，NH4+浓度最终维持在100 mmol/L。

在基础发酵中，发酵初期，高浓度的NH4+会影响菌体的生长，其最大菌体量为51，同时在发酵进行到20 h时，菌体出现明显的下降趋势，最终菌体量为38，菌体量下降幅度为13，采用双阶段NH4+发酵控制策略后，由于降低了发酵液中的NH4+浓度，解除了高浓度NH4+对菌体生长的抑制作用，因此最大菌体量达到了63，较基础发酵提高了23.5%。在发酵后期同样缓解了NH4+的高浓度抑制，使得菌体活力得到稳定，菌体衰老自溶现象缓解，最终的菌体量为58，较基础发酵提高了52.6%，下降幅度为5，降低了61.5%。

同时在采用双阶段NH4+发酵控制策略时，通过实验探究发现在L-谷氨酸发酵的前、中期，即L-谷氨酸生产的高峰期，NH4+浓度维持在300 mmol/L，发酵后期NH4+浓度维持在100 mmol/L时，发酵效果最好，此时的NH4+浓度既保证了菌体活力，又提高了L-谷氨酸生产速率和产量。由图5中L-谷氨酸生产曲线和表1可知，采用双阶段NH4+发酵控制策略后，L-谷氨酸的生产速率、最终产量和糖酸转化率都得到了提高，其最终产量为171 g/L，相较于基础发酵的153 g/L提高了11.8%；糖酸转化率也由60.2%提高到了61.6%。

2.6 双阶段NH4+发酵控制策略对谷氨酸代谢流向及副产物的影响

为了探究双阶段NH4+发酵控制工艺对谷氨酸发酵中乳酸、丙氨酸等副产物的影响，本研究对两种不同发酵控制工艺在发酵过程中前、中期的葡萄糖、L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-赖氨酸和乳酸质量积累或消耗速率进行测定，见表2。

表2 两种发酵方式代谢产物变化速率

将葡萄糖的摩尔消耗速率以100 mmol/L计算，运用MATLAB软件线性规划法分析得到两种发酵方式的代谢分布情况，结果见图6(A为基础发酵，B为NH4+双阶段发酵控制工艺)[18-19]。

图6 两种发酵方式代谢流分布图

由图6可知，在基础发酵中,L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-赖氨酸和乳酸的代谢流分别为73.52，0.83，0.93，3.97，而在NH4+双阶段发酵控制策略中L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-赖氨酸和乳酸的代谢流分别为76.37，0.65，0.73，2.93。与基础发酵相比，L-谷氨酸代谢流提高了3.9%，其余副产物分别降低了21.7%、21.5%和24.7%。

在基础发酵中高浓度的NH4+对菌体具有一定的毒害作用，影响菌体内部各种酶的活力，由图6代谢流分布图可知，采用NH4+双阶段发酵控制工艺后，由于调整了发酵液中的NH4+浓度使其最适宜于菌体生长和产酸，菌体内异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶等酶活力得到增强，代谢流更多地流向谷氨酸，另一方面，由于菌体活力增强，菌体衰老现象延缓，菌体自溶、裂解、死亡等减少使得发酵液中的蛋白、菌体碎片等大分子物质随之减少，发酵液黏度下降，泡沫减少，氧的供给与传递效率提高，因而乳酸脱氢酶等酶活下降，降低了副产物的生成[20-21]。

3 结论

本研究对NH4+双阶段发酵控制工艺进行了研究，发酵开始时采用NaOH和氨水摩尔混合比例为1∶7的调节液代替纯氨水进行pH的调节，在发酵19 h时采用NaOH和氨水摩尔混合比例为1∶3的调节液代替1∶7的调节液进行pH的调节，对菌体生长及生产性能的提高最大，在此条件下最大OD600达到了63，较基础发酵提高了23.5%，最终的菌体量为58，较基础发酵提高了52.6%，下降幅度为5，降低了61.5%。L-谷氨酸产量最终产量为171 g/L，提高了11.8%，糖酸转化率也由60.2%提高到了61.6%。同时对其代谢流进行分析后发现，L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-赖氨酸和乳酸的代谢流分别为76.37，0.65，0.73，2.93，与基础发酵相比，L-谷氨酸代谢流提高了3.9%，其余副产物分别降低了21.7%、21.5%和24.7%。因此，NH4+双阶段发酵控制工艺在稳定发酵液中NH4+浓度、提高菌体活力和产酸能力、降低副产物、使代谢流尽可能地流向谷氨酸等方面起到了积极作用，对谷氨酸的精细化控制和高效产酸具有借鉴意义。