一测多评法测定青钱柳中5种黄酮类成分含量

蒋向辉， 蒋天智， 苑 静， 王 翔

(凯里学院 化学与材料工程学院， 贵州 凯里 556011)

一测多评法测定青钱柳中5种黄酮类成分含量

蒋向辉*， 蒋天智， 苑 静， 王 翔

(凯里学院 化学与材料工程学院， 贵州 凯里 556011)

建立青钱柳中5种主要的黄酮类成分的一测多评法，验证该方法在青钱柳质量评价中应用的准确性及可行性.以木犀草素为内标，分别建立木犀草素与黄酮苷、山奈酚、槲皮素、异槲皮苷的相对较正因子，计算青钱柳中黄酮苷、山奈酚、槲皮素与异槲皮苷的量，实现一测多评.对来自3个不同地方的5个批次的青钱柳样品，同时采用外标法与一测多评法测定青钱柳中5种黄酮类成分的含量，并两种方法测得结果的差异，对一测多评法进行含量测定的科学性与可行性进行评价.结果表明5种黄酮类成分的相对校正因子在不样品中重复性较好，对于同批次样品采用一测多评法与外标法测得的结果之间没有显著性差异.以木犀草素为内标同时测定黄酮苷、山奈酚、槲皮素与异槲皮苷的一测多评法可用于青钱柳的定量分析.

青钱柳； 一测多评； 黄酮类成分； 含量

青钱柳(Cyclocaryapaliuru)又名摇钱树、麻柳、青钱李、山麻柳，系胡桃科(Juglandaceae)、青钱柳属我国特有的药用植物[1]，主要生长于我国南方山区[2].青钱柳提取物对动物脂质的过氧化有很好的抑制效果，具有较好的抗高血糖症、抗高脂血与抗炎症活性，它是我国用于预防与治疗高脂血、肥胖与糖尿病的传统中药[3-4].我国加工制造的青钱柳茶是第一个被美国食品药品监督管理局认证的抗高血糖植物茶[5].青钱柳还有抗菌、抗病毒、提神与免疫调节的作用[6].青钱柳叶片提取物中有三萜类、多糖类、黄酮类和酚类等多种植物化学成分[7]，大量的研究表明，青钱柳多糖有良好的降血脂效果[8]，但青钱柳多糖不是仅有的降血脂成分，三萜皂苷类与黄酮类成分与青钱柳的降血脂作用紧密相关[9].黄酮类成分除具有抗菌、抗癌、抗氧化、抗诱变、抗炎、抗过敏活性外，也具有良好抗糖尿病活性[10].至今已有青钱柳苷、青钱柳酸、山柰酚、槲皮素、异槲皮苷等多种黄酮类成分被分离[11].黄酮类成分是酚类植物成分中的主要类型，其不同化合物种类的生物利用度各不相同[10].植物黄酮类成分作为一种功能性食物成分成为了近年来研究与开发的热点.

近年来，对中药中主要成分进行定量分析被认为是对中药进行质量控制的有效方法，但该方法必须提供待测目标物的高纯度标准品.而一测多评法只须提供一种标准品可以同时检测多种成分的含量，该方法作为对黄连进行质量评价的方法已经被2010年版药典所采纳，随着药材成分检测分离技术的不断完善，一测多评法在大黄、三黄、白芷、赤芍等我国大宗中药材的质量评价中越来越被推广使用[12].本研究拟对青钱柳中黄酮类成分含量进行评估，为采用一测多评法进行青钱柳或青钱柳制剂中活性成分的定量分析提供参考，并为探索各成分在降血糖与降血脂中的作用机制打下基础.

1 仪器和试药

Waters2695高效液相色谱仪；PDA紫外检测器；hermo Hypersil ODS-2 column(5 μm，4.6 mm×250 mm)、 Elite Hypersil ODS-2 column(5 μm，4.6 mm×250 mm)、Thermo Fisher ODS-2 column(5 μm，4.6 mm×250 mm)与Waters Spherisorb ODS-2 column(5 μm，4.6 mm×250 mm)4种色谱柱；EmpowerTM色谱工作站软件；KQ-500DE型数控超声波清洗器；Milli-Q超纯水机.甲醇、磷酸为色谱纯，其他试剂为优级纯.木犀草素、黄酮苷、山奈酚、槲皮素与异槲皮苷标准品均购自湖南省食品药品检验研究院.

2 材料与方法

2.1 材料

青钱柳幼叶与老叶与于2011年4月与11月采收于湖南通道(109.77°E，26.16°N)、贵州雷山(108.07°E，26.38°N)、江西新余(114.92°E，27.81N)，经湖南怀化学院刘光华教授鉴定材料均为青钱柳老叶.

2.2 供试品溶液制备

取青钱柳药材，60℃烘干至恒重，粉碎过20目筛，取过筛后粉末5.00 g，加入250 mL具塞锥形瓶中，按料液比1∶15加入80%的乙醇溶液浸泡2 h，在55℃超声(60 kHz)提取1 h，继续加适量80%的乙醇以补充减少量，振摇，充分溶解，减压抽滤.再减压抽滤3次，旋转蒸发回收乙醇至干，残渣加95%甲醇转移至10 mL量瓶中，加95%甲醇至刻度，摇匀，采用0.45 μm的微孔滤膜对溶液进行过滤，所得滤液即为供试品溶液.

2.3 混合对照品溶液的制备

取异槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚、黄酮苷对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，制成质量浓度分别为155.30，110.35，174.50，125.40，137.45 μg/mL的混合对照品溶液，于4℃冰箱中避光保存，备用.

2.4 标准曲线的制备

精密吸取混合对照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL至10 mL量瓶中，分别加95%甲醇至刻度，摇匀，经0.45 μm的微孔滤膜滤过后，采用微量取样器分别吸取20 μL异槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚与黄酮苷标准品滤液注入高效液相色谱仪.以浓度(C)的对数值对峰面积(A)的对数值进行线性回归处理，得异槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚、黄酮苷的回归方程.结果表明，5种黄酮类成分在相应范围内线性关系良好(表1).

2.5 统计分析

实验数据结果采用平均数(M)表示，采用SPSS16.0软件进行方差分析与成对数据T检验，P<0.05表示两者之间差异达到显著水平.

3 方法与结果

3.1 一测多评方法学考察

3.1.1 色谱条件 反相C18柱(5 μm，250 mm × 4.6 mm)；流动相：甲醇-0.5%冰醋酸(20∶80)；流速：0.4 mL/min；进样量：20 μL；检测波长 350 nm；柱温：30℃.在该色谱条件下，混合对照品和青钱柳供试品溶液分别进样，不同批次样品中黄酮类成分都能达到基线分离(图1).

1-异槲皮苷; 2-槲皮素; 3-木犀草素; 4-山奈酚; 5-黄酮苷1-isoquercitrin; 2-quercetin; 3-luteolin; 4-kaempferol; 5-flavonoid glycoside图1 混合对照品(A)和样品(B)HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A) and sample (B)

3.1.2 相对校正因子(fsi)的计算 以木犀草素为内参物，计算fsi.fsi=fs/fi=lgAs×lgCi/lgCs×lgAi.As为内参物木犀草素峰而积，Cs为木犀草素质量百分比浓度，Ai为某待测成分i的峰而积，Ci为待测成分i的质量百分比浓度.结合“2.4”项下系列质量百分比浓度对照品溶液所得峰面积数据，分别计算木犀草素对异槲皮苷、槲皮素、山奈酚与黄酮苷的fsi，结果见表2.

表1 5种黄酮类成分的线性关系和范围Tab.1 Linear relationship and ranges of five flavonoids

表2 5种黄酮类成分的相对校正因子Tab.2 RCF of five flavonoids

3.1.3 精密度试验 采用微得取样器吸取混合对照品溶液20 μL，按“3.1.1”项色谱条件连续进样6次，计算色谱峰的峰面积，异槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚与黄酮苷峰面积的RSD分别为2.15%， 2.66%， 1.92%， 2.45%与1.88%， 结果表明，仪器精密度较好.

3.1.4 稳定性试验 分别取产自湖南通道、贵州雷山与江西新余的青钱柳供试品溶液各3份，分别于制备后0，2，4，8，16， 20，24 h进样测定，异槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚与黄酮苷峰面积的RSD分别为2.51%，1.87%， 2.43%，1.82%与1.93%，结果表明供试品溶液稳定性良好.

3.1.5 重复性试验 精密称取产自湖南通道、贵州雷山与江西新余的青钱柳供试品样品各3份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，测得异槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚与黄酮苷质量分数的RSD值分别为1.92%，2.43%，1.74%，2.42%与2.18%，表明本方法重复性良好.

3.1.6 加样回收率试验 取已测定的青钱柳老叶粉末约2.5 g，精密称定，平行6份，分别加入相当于药材中各指标成分量的对照品溶液，根据“2.2”项的方法制备供试品溶液，测定各黄酮类成分含量，计算加样回收率.结果显示，异槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚与黄酮苷的加样回收率分别为99.32%，103.2%，99.12%，98.34%与102.76%，RSD值分别为2.52%，2.47%，2.19%，1.88%与2.93%.

3.2 QAMS耐用性和系统适应性评价

3.2.1 校正因子的重现性考察 取5种黄酮类成分的混和对照品溶液，标为1号，另取混和对照品溶液分别稀释2×、10×、20×、40×，分别为2号、3号、4号和5号，在高效液相色谱仪上考察 Thermo Hypersil ODS-2 column(5 μm，4.6 mm×250 mm)、Elite Hypersil ODS-2 column(5 μm，4.6 mm×250 mm)、Thermo Fisher ODS-2 column(5 μm，4.6 mm×250 mm)与Waters Spherisorb ODS-2 column(5 μm， 4.6 mm×250 mm)4种色谱柱对校正因子的影响.测得的相对校正因子及其相对标准差(RSD)如表3所示，结果显示不同色谱柱所测得的青钱柳中5种黄酮类成分的相对校正因子之间没有显著性差异，且RSD也均小于2%.

表3 不同色谱柱对fsi的影响Tab.3 Effect of different columns on RCFs

3.2.2 待测组分色谱峰的定位 通过计算在不同色谱柱中各待测成分色谱峰与木犀草素色谱峰的相对保留时间(rsi)，对各待测成分进行定位，结果见表4.结果显示，不同仪器和色谱柱测得的rsi相对误差均小于2%，表明利用rsi进行峰的定位是可行的.

表4 不同色谱柱对rsi的影响Tab.4 Relative retention time (RRT) obtained by different columns

3.2.3 QAMS与外标法测定结果的比较 取采自不同产地的青钱柳老叶与幼叶粉末，按“2.2”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取20 μL注入液相色谱仪，按“3.1.1”项下色谱条件测定.分别采用外标法和QAMS计算青钱柳老叶与幼叶中异槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚与黄酮苷的含量，结果见表5，结果显示，对QAMS与外标法所测得的各指标成分含量进行T检验所得的P值均大于0.05，表明2种测定方法得到的含量之间无显著性差异，结果表明QAMS用于青钱柳老叶与幼叶中多种黄酮类成分质量评价是可行的.

表5 QAMS与外标法测定青钱柳黄酮类成分含量比较Tab.5 Comparison of flavonoids content in Cyclocarya paliurus by QAMS and external standard method

4 结论

在过去20年，天然产物来源的化合物大部分在临床治疗中表现了很好的效果，从我国传统的药用植物中鉴定和分离的天然化合物为疾病新型疗法的发展提供了一个很好的契机[13].药用植物中黄酮类成分中的疏水键与蛋白有较好的亲和作用，容易与酶形成集合体，因此表现出对酶的活性很好的抑制作用[14]，黄酮、黄酮醇、单宁、查尔酮、木犀草素等活性成分对胰脂肪酶有很好的抑制活性[13].Wu等[15]通过动物实验发现，青钱柳叶的水提物与醇提取物对于降血糖、降血压和抗肿瘤都有很好的效果.易醒等[16]分别采用水提法与醇提法从青钱柳叶中分离并确证了山柰酚、槲皮素和异槲皮苷等3个黄酮类化合物，谢明勇等[17]采用反相高效液相色谱法对青钱柳醇提物与水提物中3个黄酮类化合物的含量进行了比较，其中醇提物中异槲皮甙、槲皮素与山奈酚含量分别为0.543%、0.0615%与0.0387%，而水提取物中异槲皮甙、槲皮素与山奈酚含量分别为0.464%、0.0603%、0.0337%，结果表明不同溶剂提取物中3个黄酮类化合物的含量差异不明显.谭霖等[18]采用外标法同时测定青钱柳中槲皮素含量在0.0663%～0.0815%之间，山柰酚含量在0.0587%～0.0716%之间.本研究采用一测多评法测得异槲皮甙含量与前人研究结果无明显差异，但山柰酚含量在不同产地来源的青钱柳中差异较大，这可能与山柰酚的合成受气候与生态环境的影响较大有关.

本研究利用HPLC仪组合 PDA紫外检测的方法建立了青钱柳5类黄酮类成分的检测技术.本研究所测定的5种成分中，木犀草素在各样品中含量差异较小，对照品易得，故以其作为内参物建立青钱柳药材的QAMS法，该法测得青钱柳中5种黄酮类成分含量与采用传统外标法测得值之间没有显著性差异，表明本方法可以在对照品缺失的情况下，以木犀草素为对照品进行青钱柳药材中多种黄酮类成分的分析评价.本研究考察了4种不同品牌、不同型号的色谱柱对5种黄酮类成分相对校正因子重现性的影响，对相对校正因子应用性与可行性进行评价，结果表明相对校正因子不同色谱柱之间重现性较好，一测多评法测定结果与传统外标法测定结果无显著性差异，说明一测多评可以同时测定青钱柳药材异槲皮苷、槲皮素、木犀草素、山奈酚与黄酮苷.本研究为一测多评法在青钱柳药材质量控制中的应用提供了参考和依据.

在植物药中同时进行多种有效成分的含量检测将是药材质量控制发展的趋势.一测多评法是基于检测器响应与成分含量之间的线性关系的原理，通过同一标准物来换算中药材中共存的药用成分的相对转换因子，相对转换因子是根据其紫外吸收与标准品紫外吸收的相对比率来确定，这种方法适合于有相似的紫外吸收特性的多种化合物的分析.在一测多评法检测中实验参数对检测的准确性至关重要，但至今很少有准确性与影响参数的相关研究，为了进一步增强一测多评法在中药材质量评价中可行性与可信度，影响一测多评法准确性的主要实验参数及其影响方式急待全面深入的研究.

[1] ZHU K N， JIANG C H， TIAN Y S， et al. Two triterpeniods fromCyclocaryapaliurus(Batal) Iljinsk (Juglandaceae) promote glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes: The relationship to AMPK activation[J]. Phytomedicine， 2015，6: 1-10．

[2] XIE M Y， LI L. Review in studies on chemical constituents and bioactivities ofCyclocaryapaliurus[J]. Chin Tradit Herb Drugs，2001，32:365-366．

[3] DONG C J， XIE M Y， NIE S P， et al. Study on antioxidant activity ofCyclocaryapaliurus(Bata1.) Iljinskaya extracts in vitro[J]. Food Sci， 2007，28:31-34．

[4] JIANG C， YAO N， WANG Q， et al.Cyclocaryapaliurusextract modulates adipokine expression and improves insulin sensitivity by inhibition of inflammation in mice[J]. J Ethnopharmacol， 2014，153: 344-351．

[5] WANG Q Q， JIANG C H， FANG S Z， et al. Antihyperglycemic， antihyperlipidemic and antioxidant effects of ethanol and aqueous extracts ofCyclocaryapaliurusleaves in type 2 diabetic rats[J]. J Ethnopharmacol， 2013，150: 1119-1127．

[6] DENG L H， LEI J D， HE J， et al. Evaluation on genotoxicity and teratogenicity of aqueous extract fromCyclocaryapaliurusleaves[J]. The Scientific World J， 2014，2014: 1-12．

[7] XIE M Y， XIE J H. Review about the research onCyclocaryapaliurus(Batal.) Il-jinskaja[J]. J Food Sci Biotechnol， 2008，27: 113-121．

[8] HUANG M Q， SHANGGUAN X C， XU M S， et al. Studies on hypolipemic effect ofCyclocaryapaliurus(Batal) Iljinskaja polysaccharide[J]. Acta Agric Univ Jiangxiensis， 2011，33: 157-161．

[9] JIANG C H， WANG Q Q， WEI Y J， et al. Cholesterol-lowering effects and potential mechanisms of different polar extracts fromCyclocaryapaliurusleave in hyperlipidemic mice[J]. J Ethnopharmacol， 2015，176: 17-26．

[10] DENG B， SHANG X L， FANG S G， et al. Integrated effects of light intensity and fertilization on growth and flavonoid accumulation inCyclocaryapaliurus[J]. J Agric Food Chem， 2012，60: 6286-6292．

[11] XIE J H， DONG C J， NIE S P， et al. Extraction， chemical composition and antioxidant activity of flavonoids fromCyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinskaja leaves[J]. Food Chem， 2014，6(106): 1-9．

[12] WANG C Q， JIA X H， ZHU S， et al. A systematic study on the influencing parameters and improvement of quantitative analysis of multi-component with single marker method using notoginseng as research subject[J]. Talanta， 2015，134: 587-595．

[13] YAMAMOTO M，SHIMURA S， ITOH Y， et al. Anti-obesity effects of lipase inhibitor CT-II， an extract from edible herbs， Nomame Herba， on rats fed a high-fat diet[J]. Int J Obes， 2000，24: 758-764．

[14] RAHUL B B， KAMLESH K B. Pancreatic lipase inhibitors from natural sources: unexplored potential[J]. Drug Discov Today， 2007，12(19): 879-889．

[15] WU Z F， GAO T H， ZHONG R L， et al. Antihyperlipidaemic effect of triterpenic acid enriched fraction fromCyclocaryapaliurusleaves in hyperlipidaemic rats[J]. Pharm Biol， 2016，55(1): 712-721．

[16] 易 醒， 石建功， 周光雄， 等. 青钱柳化学成分研究[J]. 中国中药杂志， 2002，27(1)：43-45．

[17] 谢明勇， 余迎利， 王远兴， 等. 青钱柳黄酮化合物结构及含量[J]. 南昌大学学报(理科版)， 2002，27(1): 49-52．

[18] 谭 霖， 杨 鑫， 龙 滢， 等. 黔东南州产青钱柳黄酮类成分的含量测定研究[J].贵州科学， 2016，34(4):77-81.

DeterminationoffivemainflavonoidsincontentinCyclocaryapaliurusbymulti-componentswithsinglemarker

JIANG Xianghui， JIANG Tianzhi， YUAN Jing， WANG Xiang

(College of Chemistry and Materials Engineering， Kaili University， Kaili， Guizhou 556011)

To establish a method for simultaneously determination for the content of five main flavonoids (luteolin， flavonoid glycoside， kaempferol， quercetin and isoquercitrin) inCyclocaryapaliurusby single marker， which is feasible and accurate. Taking luteolin as internal standard substance， to establish a method for quantitative analysis of multi-components with single marker. To determinate the content of luteolin， flavonoid glycoside， kaempferol， quercetin and isoquercitrin inCyclocaryapaliurus. The contents in 5 batches of samples came from 3 different regions were determined by both external standard method and quantitative analysis multi-components by single marker(QAMS). The scientificity and feasibility of the method were evaluated by comparison of the quantitative results between external standard method and QAMS. The results showed that the relative correction factor (RCF) was perfect. The results calculated with a single marker were consistent with the results by the external standard method. The method with a single marker is accurate and feasible to evaluate the quality of Cyclocarya paliuru．

Cyclocaryapaliuru; quantitative analysis multi-components by single marker; flavonoids; content

O626.9

A

2017-04-10.

贵州省科技厅联合基金项目(黔科合LH字[2014]7219)；贵州省科学技术基金项目(黔科合J字[2015]2131)；贵州省教育厅重点项目(黔教合KY字[2014]281; 黔教合KY字[2014]228)；湖南省科技计划重点项目(2013FJ4324).

*通讯联系人. E-mail: jxfei789@163.com.

10.19603/j.cnki.1000-1190.2017.05.011

1000-1190(2017)05-0620-06