HPLC法测定地耳草中槲皮苷和异槲皮苷含量的不确定度评定

邓祖磊,洪秋菊,崔 田

(1 蚌埠市食品药品检验中心,蚌埠 233000;2 兰州职业技术学院生物工程系;*通讯作者,E-mail:yinhua625@163.com)

不确定度是评定测定结果准确性的评估参数,体现测量结果的可疑程度,反映测量过程中对测量结果有影响的随机效应和系统效应[1],在分析测试中具有重要作用。地耳草药材为藤黄科植物地耳草(HypericumjaponicumThunb.ex Murray)的干燥全草,具有清热解毒、利湿消肿、散瘀止痛等功效,用于治疗湿热黄疸、痢疾、泄泻、急性肾炎、疮痂痈肿、血吸虫病等[2]。现代研究表明,地耳草具有抗肿瘤、保肝、抑菌等作用[3],黄酮化合物是其主要活性成分[4],其中槲皮苷及其异构体异槲皮苷含量较高[5]。槲皮苷及异槲皮苷可能是地耳草抗肿瘤、保肝的物质基础[6-8],《安徽省饮片炮制规范》(2005年版)收载有地耳草[9],但该标准较简单,仅有性状和一个化学鉴别项,不能全面控制药材质量,参考文献[10]建立地耳草中槲皮苷、异槲皮苷的HPLC法测定含量,同时参考《药品检测结果不确定度指导原则(中国药典2020年版第二次征求意见稿)》、《化学分析中不确定度的评估指南》[11]及相关文献[12-16],对已建立的地耳草中槲皮苷和异槲皮苷含量测定HPLC法进行不确定度分析及评定,为测量结果的准确性提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司,配有四元梯度泵、DAD检测器和Agilent chemstation数据系统);C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm;月旭科技(上海)股份有限公司)、BS210S电子天平(德国赛多利斯仪器有限公司)、CP225D电子天平(德国赛多利斯仪器有限公司)、BGZ-246电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。

1.2 药品与试剂

槲皮苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111538-201105,纯度:92.7%)、异槲皮苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111809-201403,纯度:92.9%)、乙腈(色谱纯,美国天地有限公司,批号:13045013)、甲醇(色谱纯,美国天地有限公司,批号:14090484)、冰醋酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)、超纯水。地耳草(来源:亳州三义堂药业有限公司;批号:20151102;产地:江西)由蚌埠市食品药品检验中心副主任中药师崔田鉴定为藤黄科植物地耳草(HypericumjaponicumThunb.ex Murray)的全草。留样凭证标本存于蚌埠市食品药品检验中心标本室。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱条件:色谱柱为月旭C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-2.5%冰醋酸(19 ∶81);检测波长355 nm。进样量10μl。

系统适用性:二者理论板数均大于3 000,分离度大于1.5,符合药典要求。

1.3.2 对照品溶液制备 精密称取槲皮苷23 mg、异槲皮苷对照品12 mg,分别置20 ml容量瓶中,用80%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品贮备液。分别吸取槲皮苷、异槲皮苷对照品贮备液1.0 ml,置20 ml容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得对照品溶液。

1.3.3 供试品溶液制备 取本品粉末(过三号筛)约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50 ml 80%甲醇,称定质量,加热回流1 h,放冷,再称定质量,用80%甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。

2 结果

2.1 数学模型建立与不确定度来源分析

按外标法建立槲皮苷、异槲皮苷含量测定公式:

式中MR:对照品称样量;η:对照品纯度;AR:对照品峰面积;M0:称量瓶的质量;M1:烘干前的样品与称量瓶的质量;M2:烘干后的样品与称量瓶的质量;MS:供试品称样量。

根据上述公式,可以分析得出,含量测定的不确定度来源于对照品的纯度及称样量、烘干前后的样品与称量瓶的质量、称量瓶的质量、对照品及供试品稀释体积、对照品及供试品色谱图中同一成分的峰面积。此外,供试品和对照品峰面积的重复性等也是不确定度的来源。

由上述分析将槲皮苷及异槲皮苷含量测定的相对不确定度表达为:

2.2 不确定度各分量的评定

2.2.6 对照品色谱峰引入的不确定度μrel(AR)精密称取对照品1份,平行进样5次,记录色谱图(见图1)。槲皮苷5次色谱峰面积分别为2 075.30,2 061.50,2 065.31,2 060.26,2 079.63,异槲皮苷5次色谱峰峰面积分别为1 157.70,1 145.00,1 151.30,1 150.23,1 152.23,平均峰面积分别为As1=2 068.40和As2=1 151.35。采用极差法计算,极差分别为Rq=19.37和Riq=12.7。当n=5时,极差系数2.33。槲皮苷与异槲皮苷对照品色谱峰峰面积引入的相对不确定度分别为:

图1 对照品溶液槲皮苷、异槲皮苷色谱图Figure 1 Chromatogram of reference solutions of isoquercitrin,quercitrin

2.2.7 供试品色谱峰引入的不确定度μrel(AS)采用双样平行法测定,每份供试品溶液进样2次,色谱图见图2。供试品溶液1的槲皮苷、异槲皮苷色谱峰峰面积分别为1 403.50,1 401.90,722.30,717.20。供试品1中槲皮苷、异槲皮苷的极差分别为Rq1=1.6和Riq1=5.1,平均值分别为1 402.70和719.75。供试品溶液2的槲皮苷、异槲皮苷色谱峰峰面积分别为1 377.20,1 375.10,712.80和706.20,两者的极差值分别为Rq2=2.1和Riq2=6.6,平均峰面积分别为1 376.15和709.50。采用极差法计算[1],当n=2时,极差系数C=1.33,槲皮苷与异槲皮苷对照品色谱峰峰面积引入的相对不确定度分别为:

图2 供试品溶液色谱图Figure 2 Chromatogram of sample solution of Hypericum japonicum Thunb.ex Murray

供试品引入的相对不确定度分别为:

2.3 不确定度各分量的相对标准不确定度统计与标准合成不确定度扩展不确定度的计算

不确定度各分量的相对标准不确定度统计结果见表1,2。

表1 槲皮苷的相对不确定度各分量表Table 1 Relative uncertainty of each component for quercitrin

表2 异槲皮苷的相对不确定度各分量表Table 2 Relative uncertainty of each component for isoquercitrin

根据上述计算结果,按公式③计算槲皮苷、异槲皮苷的标准不确定度分别为:

实验中,按外标法计算,该批地耳草样品的槲皮苷和异槲皮苷含量分别0.40%和0.39%,因此,槲皮苷和异槲皮苷的合成不确定度分别为:μq=0.40%×6.32×10-2=2.53×10-4,μiq=0.39%×1.17×10-1=4.56×10-4。选择包含因子k=2,置信概率为95%时[15],则槲皮苷、异槲皮苷的扩展不确定度分别为Uq=2×2.53×10-4=5.06×10-4,Uiq=2×4.56×10-4=9.12×10-4。因此,地耳草中槲皮苷和异槲皮苷的含量测定结果分别为(0.40±0.05)%和(0.39±0.09)%,k=2。

3 讨论

从相对不确定度分量表1,2中可以看出,地耳草中槲皮苷含量测定不确定度的主要来源于对照品称量,高效液相色谱仪和对照品、样品溶液的稀释对不确定度贡献也较大,异槲皮苷含量测定不确定度的主要来源与槲皮苷类似,但供试品峰面积对其不确定度贡献也较大,而对照品纯度和水分对二者不确定度贡献相对较小。

不确定度评定结果提示在实际检验操作过程中,首先要保证实验仪器、计量器具等均应计量检定合格,并注意维护和保养,对照品称量应选择合适量程及精度的电子分析天平,以提高称量的灵敏度和准确性;其次在实验时适当增加对照品的取样量、稀释过程尽可能选用体积相对较大的量具并尽可能减少稀释步骤,增加平行样测定,也可以适当减少不确定度分量所占的比重。