不同产地苦荞麦中黄酮类成分的含量测定与分析

（劲牌生物医药有限公司，中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北大冶435100）

苦荞麦为蓼科（Polygonaceae）荞麦属植物苦荞麦（Fagopyrum tataricum L.Gaertn）的干燥成熟种子，又名野荞麦、鞑靼荞、万年荞、野南荞[1]。《本草纲目》中记载：苦荞麦味苦、性平寒，有益气力、续精神、利耳目、降气、宽肠健胃的作用。苦荞麦营养丰富，含有黄酮类化合物（如芦丁、槲皮素、山萘酚等，其中芦丁含量较多）、多种氨基酸、肌醇衍生物、多糖、不饱和脂肪酸及多种微量元素等成分[2-7]。现代药理研究表明，苦荞麦具有抗氧化、抗肿瘤、抗敏、抗菌、抗病毒、降血脂、降血压等作用[8-11]。苦荞麦主要集中种植在我国西南地区的四川、云南、陕西、甘肃、山西、贵州等省的高海拔山区、高原和高寒地区[12]，四川凉山和云南昭通地区为主要产地。试验建立苦荞麦中芦丁、槲皮素、山奈酚、山奈酚-3-o-芸香糖苷4种黄酮类成分的含量测定方法，选用四川、云南重点产区及贵州、陕西产地的苦荞麦样品，分别对其中的4种黄酮类成分进行含量测定与对比，为苦荞麦原料的采购提供技术依据。

1 试验材料

1.1 仪器与设备

1200型高效液相色谱仪：美国安捷伦科技公司；AB135-S型电子天平：梅特勒-托利多公司；W3-100SP型恒温水浴锅：上海申生公司。

1.2 材料与试剂

苦荞麦样品（采自不同产地）：直接在产地收集；芦丁标准品（批号：100080-201610，纯度：91.9%）、槲皮素标准品（批号：100081-200907，纯度 96.5%）、山奈酚标准品（批号：100861-201310，纯度 93.2%）、山奈酚-3-o-芸香糖苷标准品（批号：100083-201509）：中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈（色谱纯）：Fisher Chemical；磷酸（色谱纯）：Honeywell；无水乙醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

2 试验方法

2.1 色谱条件

液相色谱条件：紫外检测器，Sepex C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相；按照表1条件进行梯度洗脱，检测波长为360nm，流速 1.0 mL/min，进样体积：10 μL，柱温：30 ℃，上述色谱条件下，芦丁、山奈酚-3-o-芸香糖苷、槲皮素、山奈酚对照品高效液相色谱图见图1。

表1 梯度洗脱表Table 1 Gradient elution table

图1 芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山奈酚混合对照品高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of a mixture of rutin，quercetin，kaempferol and kaempferol-3-o-rutinoside

2.2 供试品溶液制备

取苦荞麦样品粉碎，过四号筛，精密称取粉末3 g，精密加入60%乙醇50 mL，称定重量，90℃水浴回流2 h，取出，冷却，称重，并用60%乙醇补足减失的重量，用0.45 μm微孔滤膜过滤后取续滤液作为供试品溶液。

2.3 对照品溶液制备

分别精密称取芦丁对照品47.24 mg于10 mL容量瓶中、山奈酚-3-o-芸香糖苷对照品20.89 mg于50 mL容量瓶中、槲皮素对照品14.51 mg于50 mL容量瓶中、山奈酚对照9.31 mg于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，作为对照品储备液，芦丁、山奈酚-3-o-芸香糖苷、槲皮素、山奈酚的浓度分别为4 341.356、417.8、280.043、173.538 4 mg/L。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围试验

分别精密吸取2.3项下芦丁对照品储备液9 mL、山奈酚-3-o-芸香糖苷对照品储备液8 mL、槲皮素对照品储备液2 mL、山奈酚对照品储备液5 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，得到混合对照品使用溶液，其中芦丁、山奈酚-3-o-芸香糖苷、槲皮素、山奈酚浓度分别为1 562.888 16、133.696、22.403 44、34.707 68mg/L。分别吸取上述混合对照品使用溶液0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、5.0、10.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，用0.45 μm微孔滤膜过滤后作为对照品溶液。按照2.1色谱条件进行色谱分析，经色谱分析分别得到各浓度芦丁、山奈酚-3-o-芸香糖苷、槲皮素、山奈酚对照品色谱峰的峰面积，分别以对照品溶液浓度（x）为横坐标，以对照品溶液峰面积（Y）为纵坐标建立标准曲线。

芦丁标准曲线方程：Y=9.543 206 76x+82.471 516，R2=0.999 56；山奈酚-3-o-芸香糖苷标准曲线方程：Y=7.999 238 67x+3.329 378，R2=0.999 84；槲皮素标准曲线方程：Y=21.907 088 9x+0.188 849 5，R2=0.999 95；山奈酚标准曲线方程：Y=23.426 031 9x+1.950 813 3，R2=0.999 85；结果表明，芦丁浓度在15.028 88 mg/L～1 562.888 16 mg/L范围内线性关系良好，山奈酚-3-o-芸香糖苷在1.336 96 mg/L～133.696 mg/L范围内线性关系良好，槲皮素在0.224 03 mg/L～22.403 44 mg/L范围内线性关系良好，山奈酚的浓度在0.347 08 mg/L～34.707 86 mg/L范围内线性关系良好。

2.4.2 精密度试验

精密称取苦荞麦样品3.086 7 g，按照2.2方法制备供试品溶液，在2.1色谱条件下连续进样6次，记录各成分的色谱峰面积，结果芦丁、山奈酚-3-o-芸香糖苷、槲皮素、山奈酚峰面积的RSD值分别为0.32%、0.31%、0.39%、1.79%，表明仪器的精密度良好。

2.4.3 稳定性试验

取2.4.2供试品溶液，分别在2.1色谱条件下于0、1、2、4、8、12 小时进样，记录各成分的色谱峰面积，结果芦丁、山奈酚-3-o-芸香糖苷、槲皮素、山奈酚峰面积的RSD值分别为0.47%、0.45%、0.40%、1.73%，表明供试品溶液在12小时内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验

精密称取苦荞麦样品6份，每份3 g，按照2.2方法制备供试品溶液，在2.1色谱条件下进行色谱分析，利用建立的标准曲线分别计算各供试品溶液中各成分的含量。结果样品中芦丁、山奈酚-3-o-芸香糖苷、槲皮素、山奈酚的平均含量分别为1.884%、0.133%、0.012 7%、0.000 73%，重复性试验的RSD值分别为1.38%、1.41%、1.61%、2.57%，表明检测结果重复性良好。

2.4.5 加标回收试验

精密称取苦荞麦样品6份，每份0.75 g，分别加入相当于样品中芦丁、山奈酚-3-o-芸香糖苷、槲皮素、山奈酚含量的80%、100%、120%3个梯度的对照溶液各2份，按照2.2方法制备供试品溶液，在2.1色谱条件下进行色谱分析，利用标准曲线计算芦丁、山奈酚-3-o-芸香糖苷、槲皮素、山奈酚的含量及回收率。计算所得芦丁、山奈酚-3-o-芸香糖苷、槲皮素、山奈酚的平均回收率分别为98.80%、105.88%、96.08%、107.04%，加标回收试验的RSD值分别为3.54%、2.61%、3.47%、3.32%，表明检测方法的准确度良好。具体数据见表2～表5。

表2 芦丁加标回收试验数据Table 2 Data of rutin plus standard recovery test

表3 山奈酚-3-o-芸香糖苷加标回收试验数据Table 3 Data of kaempferol-3-o-rutinoside plus standard recovery test

表4 槲皮素加标回收试验数据Table 4 Data of quercetin plus standard recovery test

表5 山奈酚加标回收试验数据Table 5 Data of kaempferol plus standard recovery test

3 试验结果

3.1 样品测定

按试验方法测定采自不同产地的苦荞麦样品中4种黄酮类成分的含量，样品产地来源及测定结果见表6。

3.2 成分比较

对各产地苦荞麦样品中的有效成分芦丁、槲皮素、山奈酚、山奈酚-3-o-芸香糖苷含量进行统计分析，对各产地成分含量的最小值、最大值、极差和均值进行统计，同时对所有样品的成分含量进行趋势图分析。

3.2.1 芦丁成分

芦丁含量：主产地比较四川省比云南省略高，其他产地以贵州省略高，整体趋势分析各产地的芦丁含量差别不大，具体数据见表7和图2。

表6 不同产地苦荞麦黄酮含量测定结果Table 6 Results of flavonoids content determination in buckwheat from different areas

表7 芦丁含量统计数据Table 7 Statistics of rutin content

图2 芦丁含量分析Fig.2 Analysis of rutin content

3.2.2 槲皮素成分

槲皮素含量：主产地比较四川省比云南省低，整体趋势分析云南省槲皮素含量明显高于其他产地，其他产地的槲皮素含量差别不大，具体数据见表8和图3。

3.2.3 山奈酚成分

山奈酚含量：主产地比较四川省比云南省低，整体趋势分析云南省山奈酚含量明显高于其他产地，其他产地的山奈酚含量差别不大，具体数据见表9和图4。

表8 槲皮素含量统计数据Table 8 Statistics of quercetin content

图3 槲皮素含量分析Fig.3 Analysis of quercetin content

表9 山奈酚含量统计数据Table 9 Statistics of kaempferol content

3.2.4 山奈酚-3-o-芸香糖苷成分

山奈酚-3-o-芸香糖苷含量：主产地比较四川省和云南省基本一致，其他产地以陕西省略高，整体趋势分析各产地的含量差别不大，具体数据见表10和图5。

表10 山奈酚-3-o-芸香糖苷含量统计数据Table 10 Statistics of kaempferol-3-o-rutinoside content

图4 山奈酚含量分析Fig.4 Analysis of kaempferol content

图5 山奈酚-3-o-芸香糖苷含量分析Fig.5 Analysis of kaempferol-3-o-rutinoside content

4 结论

试验建立苦荞麦中黄酮类成分芦丁、槲皮素、山奈酚、山奈酚-3-o-芸香糖苷含量检测方法，并对该方法进行核实，包括线性范围试验、精密度试验、稳定性试验、重复性试验及加标回收试验，结果表明该方法操作简便，重复性好，检测结果准确、可靠，可用于苦荞麦中黄酮类成分的含量测定。同时通过该方法的建立，改变了目前苦荞麦只控制芦丁及总黄酮成分含量的现状，能够更加客观地反映苦荞麦原料的内在质量。

通过对苦荞麦主产地四川、云南、贵州、陕西产地样品中4种黄酮类成分的含量测定与分析比较，发现各产地样品中成分存在一定的差异，其中云南产苦荞麦中槲皮素、山奈酚含量明显高于其他产地，芦丁、山奈酚-3-o-芸香糖苷含量相差不大，为苦荞麦原料的采购及应用提供了技术依据。