益气健脾法对脾虚痰浊AS猪肾组织AQP的影响❋

石月萍，贾连群，宋 囡，刘晶晶，杨关林

(辽宁中医药大学， 辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室，沈阳 110847)

【实验研究】

益气健脾法对脾虚痰浊AS猪肾组织AQP的影响❋

石月萍，贾连群，宋 囡，刘晶晶，杨关林Δ

(辽宁中医药大学， 辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室，沈阳 110847)

目的：探讨脾虚痰浊动脉硬化(AS)巴马小型猪肾组织水通道蛋白的改变及益气健脾法的干预作用及机制。方法：将15只巴马小型猪随机分为正常组、模型组(脾虚痰浊AS模型)、益气健脾组各5只，以高脂饮食喂饲加跑步劳倦结合冠脉球囊拉伤建立脾虚痰浊AS模型。正常组巴马小型猪喂饲正常饲料，模型组球囊冠脉拉伤后高脂饲料结合跑步过劳制备脾虚痰浊AS模型，益气健脾组在模型组处理基础上于高脂饲料中添加益气健脾中药，观察48周后各组巴马小猪的肾脏组织病理形态学改变，肾组织环磷酸腺苷(cAMP)含量、水通道蛋白(AQP)1、2、3及磷酸化蛋白激酶A(p- PKA)、磷酸化cAMP反应原件结合蛋白(p- CREB)表达变化。结果：与正常组比较模型组肾组织病理形态学可见肾小球及肾小管损伤，肾组织AQP1、2、3下调，cAMP/PKA/CREB通路下调，与模型组比较益气健脾组可上调肾组织AQP1、2、3及cAMP/PKA通路。结论：脾虚痰浊AS模型可见肾组织病理损伤，肾组织AQP1、2、3下调，益气健脾法可改善肾组织病理损伤，上调脾虚痰浊AS模型肾脏水通道蛋白的异常，其机制可能与调节cAMP/PKA通路相关。

益气健脾法；脾虚痰浊；动脉粥样硬化；水通道蛋白

随着人们饮食结构的改变，过多高脂饮食的摄入使脂质逐渐沉积在人体动脉血管壁形成动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)，AS也是冠心病、糖尿病、脑梗死等疾病的基本病理基础。脾虚痰浊是高脂血症及当今冠状动脉粥样硬化性心脏病的主要证候[1- 2]。中医理论认为肥甘厚味为“膏脂”，过量膏脂饮食超过人体脾胃的运化能力，不能化为精微运化至全身，停于体内而成脂浊，阻滞气血脉道，最终致痰瘀阻于心脉而致胸痹(冠心病)。杨关林教授课题组梳理了古今从脾论治冠心病文献[3]，总结了路志正、邓铁涛等名老中医从脾论治冠心病的经验[4]，课题组在以痰瘀论治冠心病的临床实践基础上[5- 7]，提出冠心病痰瘀互结证从脾胃论治[8- 10]的心脾同治理念[11]。课题组建立了脾虚痰浊高脂大鼠模型，探讨了脾虚膏脂转输异常的现代生物学机制[12]。在脾虚高脂及AS中，脾虚痰浊内生的主要机制之一为脾虚膏脂转输异常，膏脂不化而成痰浊(脂浊)；而脾虚则运化水湿失常、水湿内停，也是脾虚痰浊证必然存在的病理状态。在脾虚高脂大鼠模型及脾虚痰浊AS模型中可见腹泻或便溏症状，说明脾虚高脂模型存在脾虚水湿不化、留滞于胃肠的湿郁状态，湿郁状态必然会阻滞气机和气血运行。

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)与细胞上转运水的通道蛋白及细胞内外的水平衡具有密切联系，因此湿病与水通道蛋白的异常表达密切相关[13]。而肾组织水通道蛋白的表达与全身的水盐代谢有密切关系[14]，全身的湿郁状态可能与肾脏水通道蛋白表达失常有关。

课题组在益气健脾法调节脾虚高脂大鼠膏脂转输异常及机制的研究基础上[15]，建立巴马猪脾虚痰浊AS巴马猪模型，发现巴马猪出现血脂的升高及冠状动脉的斑块形成[16]。通过动物行为学及量表观察，出现脾虚证候[17- 18]表明，脾虚痰浊AS模型成功，模型猪存在便溏之脾虚湿盛状态[19]。为进一步探讨脾虚湿郁形成机制，本研究观察脾虚痰浊巴马猪肾组织AQPs的表达及益气健脾法的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6～8月龄普通级去势巴马小型猪15只，体质量(29.88±2.27) kg，由泰州泰和生物科技有限公司提供(许可证号SCXK(苏)2001- 0002)。医学伦理符合辽宁中医药大学实验动物管理条例规定和中华人民共和国卫生部动物实验管理条例(55,2001)。巴马小型猪在实验室温度为(20.80±2.97)℃、湿度(47.30±15.31)%的环境中单笼饲养。

1.2 实验药物

选用益气健脾中药，采用免煎配方颗粒，购于江苏江阴天江药业有限公司。药物组成：党参(批号1403032)、白术(批号1403081)、茯苓(批号1403097)等，巴马小型猪给药剂量为0.825 g/kg。于脾虚痰浊AS造模成功后给药，将上述颗粒剂溶于100 ml生理盐水中，混于饲料中(每周称重，按照3%猪的体质量计算)进行喂饲。

1.3 实验试剂

异氟烷，鲁南贝特制药有限公司(批号H20020267)；利多卡因，上海朝晖药业有限公司(批号H31021072)；丙泊酚泛影葡胺，湖南汉森制药有限公司(批号H43021120)；PBS，Biotopped(批号 140916)；肝素，上海第一生化药业有限公司(批号H31022051)；Rabbit Anti- AQP1 antibody (bs- 1506R)、Rabbit Anti- AQP3 antibody (bs- 1253R)、Rabbit Anti- AQP4 antibody (bs- 0634R)，均购于北京博奥森生物科技有限公司。AQP2抗体(H- 40)Sc- 28629、PKAα/β/γcat抗体(H- 55)(Sc- 98951)、磷酸化特异性抗体PKA(Sc- 32986)均购于Santa Cruz。cAMP Elisa试剂盒购自上海沪宇生物科技有限公司；SDS- PAGE凝胶试剂盒(37K00130)、BCA蛋白定量试剂盒(37B00150)、辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体均购于北京鼎国昌盛生物科技有限公司。

1.4 实验仪器

小动物吸入麻醉机，北京益仁恒业科技有限公司(型号 VMR);6F 鞘管日本 TERUMO(型号 RS×A6K10SQ);数字减影血管造影机，DSA：荷兰 PHILIPS(型号 Arrula);PT2 指引导丝，美国 BOSTON SCIENTIFIC CORPORATION(型号 38931- 01);超薄切片机(LKB- 1)、台式高速冷冻离心机(3K15)，Sigma公司；全自动生化检测仪(7170A)，日本日立公司；酶标仪、ChemiDoc XRS+化学发光成像系统(Bio- Rad)，美国伯乐生命医学产品有限公司；垂直电泳仪(HE- 180)、转移电泳槽(VE- 1861)，上海天能科技有限公司。

1.5 模型复制

按文献[20]法采用高脂饮食及疲劳过度法建立巴马猪脾虚痰浊证候模型，以高脂饮食结合前降支中远段1/3处的冠脉球囊拉伤法复制AS疾病模型，模型评价参见文献[16- 19]。

正常组巴马小型猪给予基础饲料喂养，不进行跑步及冠脉球囊拉伤。模型组及益气健脾组巴马猪给予高脂肪高热量饲料喂养2周，于第3周行冠脉球囊拉伤术，术前禁食水，采用丙泊酚及5%异氟烷吸入复合麻醉，右股动脉穿刺后，数字减影血管造影机透视下将 6Fjudkins R3.5 指引导管沿着导丝送至左冠状动脉开口，推注造影剂泛影葡胺(30 ml)后造影将指引导丝(PT2 导丝)送至前降支中远段1/3处，以8～14 atm扩张球囊，移动球囊幅度大约5 mm，连续 5次，每次30 s，间隔30 s。造影观察即刻血管影像，沿导丝送入超声导管行血管内超声检查。第6周开始每日使用跑步机(小型猪专用)，以0.8 km/h为初始速度，以30 s为稳态时间间隔，增加0.3 km/h或其倍数，达到最高跑步速度2.1～5.4 km/h，持续15 min内，使巴马小型猪跑步力竭(趴地不起为止)。24周后益气健脾组将益气健脾中药免煎颗粒水溶后拌于高脂饲料中，喂饲饲料量以每周称重后计算，日进食量以体质量的3%投放饲料，加入中药(0.825 g/kg饮片剂量)拌于饲料中。实验48周麻醉巴马小型猪后于其动脉取血离心取上清，-80℃冰箱冻存备用；分离切取肾组织，生理盐水清洗，冰下将皮质部位切成小块1 cm3，一部分固定于4%多聚甲醛中，一部分置于-80℃冰箱保存待测。

1.6 ELISA法检测肾组织环磷酸腺苷含量

取-80℃冰箱冻存的肾脏组织，每只小型猪肾组织称重切取100 mg冰上制备匀浆，测定蛋白浓度，取96孔板按照说明书设定标准孔、待测样品孔和空白孔。在标准孔中加入50 μl梯度稀释的标准品。于样品孔中加入稀释液40 μl，再加入样品10 μl，即待测样品为5倍稀释。温育30 min后，加入酶标试剂100 μl洗涤5次。加显色液A、B各50 μl，显色15 min，终止液50 μl，终止反应后15 min，在450 nm波长处测定各孔吸光度。计算各样品浓度(ELISA Calc 回归/拟合计算程序软件v0.1)。

1.7 苏木素(Hematoxylin)- 伊红(Eosin)染色观察肾组织病理形态学

取固定后的肾组织皮质部分常规脱水，石蜡包埋，制作石蜡切片。石蜡切片经二甲苯、无水乙醇脱蜡、染色(苏木精- 伊红)，每只动物肾组织切片于显微镜下取10个视野，拍照后观察肾小球及肾小管形态。

1.8 Western- blot法测定肾组织AQP1、2、3，PKA、pPKA、CREB、p- CREB表达

取冰冻肾组织100 mg加入裂解液1 ml，匀浆器中匀浆，4℃12000 r/min离心10 min取上清，BCA试剂盒测定蛋白浓度、制胶、上样，在垂直电泳槽中进电泳。将蛋白转印到PVDF膜上，5 %脱脂奶粉中37 ℃封闭120 min，加AQP1、2、3及PKA、p- PKA、CREB、p- CREB一抗孵育，TBS- T洗膜液洗涤 3次，辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育，TBS- T洗膜、ECL显影、扫描成像，并用Alphaview SA图像分析软件分析各组蛋白条带灰度值。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 肾组织病理形态学改变

图1显示，正常组肾小球结构清晰，肾小囊、肾小管腔隙明显。模型组肾小球肿胀，肾小囊、肾小管腔隙变窄，肾小管可见排列紊乱，集合管中可见管型，肾小管细胞肿胀，排列紊乱。益气健脾组肾小囊、肾小管可见腔隙，但较正常组变窄，肾小球肿胀较模型组有缓解，但肾小管的排列紊乱没有减轻，肾小管腔隙增宽，但肾小管损伤明显，并有炎症细胞浸润。

图1 光镜下各组肾肌组织病理变化(200×)

2.2 各组巴马小型猪肾组织cAMP含量

表1显示，模型组肾组织cAMP较正常组降低，差异有统计学意义。益气健脾组较模型组cAMP升高并有恢复作用，差异有统计学意义。

表1 肾组织cAMP含量比较

注：与模型组组比较:*P<0.05

2.3 各组肾组织AQP1、2、3，PKA、p- PKA、CREB、p- CREB蛋白表达

表2图2～4显示，与正常组比较，模型组肾组织AQP1、2、3蛋白表达均有下调，差异有统计学意义(P<0.05)；PKA及CREB蛋白表达无下调(P>0.05)，而p- PKA、p- CREB蛋白表达有下调(P<0.05)，说明模型组肾脏AQP1、2、3表达下调，与cAMP依赖的PKA磷酸化、CREB磷酸化激活AQP的表达有关。与模型组比较，益气健脾组AQP1、2、3、p- PKA蛋白表达均有上调，差异有统计学意义(P<0.05)，说明益气健脾组具有上调cAMP/PKA通路和肾组织AQP1、2、3而起到恢复肾脏浓缩功能作用。

表2 肾组织AQP1、2、3，PKA、p- PKA、CREB、p- CREB蛋白表达比较

注：与模型组比较：*P<0.05，P<0.01

图2 各组肾组织AQP1、2、3蛋白表达

图3 各组肾组织PKA、p- PKA蛋白表达

图4 各组肾组织CREB、p- CREB蛋白表达

3 讨论

AQPs是体内调节细胞内外水平衡的跨膜蛋白，在机体内广泛分布于与体液分泌、吸收相关的上皮细胞及内皮细胞中，参与各部位的水重吸收、体液分泌以及细胞外的水平衡。近年认为，体内津液代谢疾病均有局部及全身水通道蛋白的失调[21]。AQP 在肾、肺和消化系统等器官广泛存在，中医理论认为机体津液代谢主要与肺、脾、肾三脏相关，脾主运化水液是中医津液代谢枢纽，因此AQP 的正常表达可能是脾主运化水液的分子生物学基础。

肾脏AQP包括AQP1、2、3、4、6，其中与尿液浓缩密切相关的是AQP1、2、3。AQP1分布于肾脏近曲小管及亨氏袢降支细段管腔膜，90%肾小球滤过液通过AQP1转运，并经AQP1浓缩。AQP2分布于肾脏近曲小管主细胞和内髓部集合管上皮细胞顶部质膜上，约10%肾小球滤过液经过AQP2被重吸收。AQP3位于肾脏集合管上皮细胞基侧质膜，除了在尿液浓缩中起作用外，还可转运尿素、甘油等[22]。综上所述，肾脏AQP1、2、3的表达异常影响决定全身的水代谢。

AQP受渗透压、PH、糖皮质激素、盐皮质激素调节以及其他蛋白调节。宋囡[23]等观察脾虚证大鼠胃组织cAMP/PKA通路表达，说明cAMP/PKA通路与脾虚证相关。其中cAMP/PKA信号通路不仅调节AQP的表达，也参与调节糖代谢，并与脾虚证有关[24]。cAMP/PKA/CREB途径是细胞内经神经递质及激素作用于细胞膜上的G蛋白耦联受体，激活腺苷酸环化酶，腺苷酸环化酶催化ATP水解生成cAMP，继而cAMP与PKA的调节亚基结合，活化cAMP依赖的PKA，使PKA磷酸化，PKA可使AQP的4个丝氨酸位点(Ser256、Ser261、Ser264、Ser269)中的Ser256、Ser264、Ser269位点磷酸化增加，Ser261磷酸化减少。而cAMP与PKA的调节亚基结合后释放的催化亚基转位至细胞核内，激活CREB在Ser133位点磷酸化，启动AQP的转录而调节AQP 的表达[25]，说明cAMP/PKA通路调节AQP的表达，从而调节膜对水的通透性。

综上所述，AQPs与湿郁有关[13]，全身的湿郁状态可能与肾脏AQPs失常有关[14]。课题组建立了巴马猪脾虚痰浊AS巴马猪模型，结果巴马猪不仅出现血脂升高及冠状动脉的斑块形成[16]，动物行为学及量表评价，出现懒动、便溏等症，说明脾虚证候成立[17- 18]，脾虚痰浊AS模型可能伴随脾虚湿郁状态。为进一步探讨可能的湿郁形成机制，本研究观察脾虚痰浊巴马猪肾组织AQP的表达及益气健脾法的作用。

研究结果显示，以动物行为学及动物脾虚量表进行脾虚痰浊证候模型评价[18]，模型组巴马猪出现倦怠懒动、皮毛不光泽、便溏等脾虚症状，表明脾虚痰浊证候模型复制成功[20]。模型组血脂高于正常组，血脂数值课题组已发表文献[16]，冠脉造影及血管内超声评价冠脉拉伤处内膜损伤，病灶处血管内膜下可见大量泡沫细胞证明AS病理改变[16]，通过以上综合评价表明脾虚痰浊AS证候及疾病模型复制成功。

脾虚痰浊AS巴马猪出现便溏、倦怠等脾虚的一般症状，说明脾虚痰浊巴马猪可能存在脾虚湿郁的病理状态。脾虚痰浊AS巴马猪模型肾组织可见肾小球肿胀、肾小管细胞排列紊乱肿胀、间隙变小的改变，模型组肾组织AQP1、2、3蛋白表达比正常组下调，模型组的cAMP、p- PKA、p- CREB表达同时下调，而AQP又受cAMP依赖的PKA调节，说明脾虚痰浊AS巴马猪的肾小管的损伤，与分布于肾小管细胞的AQPs下调有一定联系，肾脏AQPs的表达与全身的水盐代谢有着密切联系，肾脏AQP下调可能受cAMP/PKA/CREB信号通路的调节。模型组肾组织改变和水通道蛋白变化及cAMP/PKA/CREB通路可能与脾虚痰浊模型的湿郁状态有关。

益气健脾组肾组织的肾小球肿胀减轻，肾小管细胞肿胀及排列紊乱均有减轻，肾组织AQP1、2、3蛋白表达及cAMP、p- PKA蛋白表达均有上调，但对于p- CREB没有上调，说明益气健脾法能够减轻脾虚痰浊AS巴马猪模型的肾小球及肾小管损伤，与上调肾组织AQP1、2、3作用与cAMP/PKA通路有关，而益气健脾组对于p- CREB的表达没有上调，分析可能有其他蛋白分子参与PKA下游p- CREB的调节。益气健脾法对脾虚痰浊AS模型肾组织病理改变及对水通道蛋白的调节可能与恢复脾虚痰浊模型的湿郁状态有关。

本研究结果说明，以高脂喂饲加跑步劳倦结合冠脉球囊拉伤血管内皮方法复制的脾虚痰浊AS模型猪存在肾小球及肾小管损伤及肾脏AQP1、2、3、cAMP/PKA通路下调。益气健脾法对脾虚痰浊AS模型猪肾小球及肾小管损伤有保护作用，并能上调脾虚痰浊巴马猪肾组织AQP1、2、3蛋白表达，可能与调节cAMP/PKA信号通路有关。

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Effect of Replenishing Spleen Qi Deficiency Phlegm Method on AQP in the as Kidney Tissue

SHI Yue- ping, JIA Lian- qun, SONG Nan, LIU Jing- jing, YANG Guan- linΔ

(Liaoning University of Traditionnal Chinese Medicine，Shenyang 110847, China)

Object：To observe the changes of kidney water channel protein and cAMP/PKA signal pathway with the spleen dificiency and phlegm atherosclerosis bana mini- pig model and effect of the replenishing spleen on the model. Method: Fifteen bama minipigs were randomly divided into normal group，model group and replenishing spleen group with five in each. The spleen dificiency and phlegm atherosclerosis model were instant by high fat diet combined tied by running after balloon injury in the coronary artery.The bama minipigs of normal group were fed normal basic diet for 48 weeks,model group were fed high fat and high calorie fodder for 48 weeks. The bana mini- pigs of replenishing spleen group were gived replenishing spleen recipe on the basis of the method on model group after 24 weeks. Observing Cyclic adenosine monophosphate(cAMP)、morphology and the protein expression of aquaporins (AQP)1、2、3、phosphorylation protein kinase A(p- PKA)、phosphorylated cAMP- response element binding protein(p- CREB) in the mini- pigs kidney after 48weeks.Result：Compared with normal group，morphology of kidney of the model group show the pathological damage in the glomerular and tubular，expression of AQP1、2、3 and cAMP/PKA/CREB pathway were reduced.Compared with normal group，replenishing spleen group increased expression of AQP1、2、3 and cAMP/PKA pathway in the bama mini- pigs kidney.Conclusion: Spleen deficienly and phlegm atherosclerosis model show morphology of the kidney and decrease of AQP1，2，3，methods for replenishing spleen can regulate abnormal water metabolism regulatory proteins，possibly related to cAMP/PKA pathway.

Method for replenishing spleen Qi; Spleen dificiency and phlegm; Atherosclerosis; Aquaporins

辽宁中医药大学中医脏象理论及应用国家教育部重点实验室开放基金资助项目(ZYZX1515);辽宁省中医外治心血管系统疾病转化医学研究中心建设资助项目(2014225004)

石月萍(1968- )，女，辽宁鞍山人，教授，医学博士，从事中医药防治心血管疾病的临床与研究。

R285.5

B

1006- 3250(2017)07- 0939- 05

2017- 01- 15

△通讯作者：杨关林，男，黑龙江肇东人，教授，博士研究生导师，从事中医药防治心脑血管疾病与中医藏象理论研究，Tel：024- 31207046，E- mail：yang_guanlin@163.com。