毛冬青总皂苷对小鼠脑缺血再灌注模型的影响❋

曹利华，刘蕊莉，苗明三

(河南中医药大学，郑州 450000)

【实验研究】

毛冬青总皂苷对小鼠脑缺血再灌注模型的影响❋

曹利华，刘蕊莉，苗明三△

(河南中医药大学，郑州 450000)

目的：探讨毛冬青总皂苷对小鼠脑缺血再灌注模型的作用机制及特点。方法：将小鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、尼莫地平组、金纳多组、毛冬青总皂苷大、中、小剂量组7组。采用阻断小鼠双侧颈总动脉缺血10 min、恢复灌流10 min、再缺血10 min、恢复供血、再灌注24 h，研究毛冬青总皂苷对脑缺血再灌注小鼠的NO水平和NOS活力，Na+- K+- ATP酶、Mg2+- ATP酶、Ca2+- ATP酶的含量以及脑组织神经细胞的影响。结果：小鼠脑缺血再灌注模型复制成功，毛冬青总皂苷可显著降低脑匀浆中NO水平、NOS活力、升高脑匀浆中ATP酶活力，并显著减轻脑组织海马区和皮质区神经细胞的损伤，均以大剂量、中剂量为优。结论：毛冬青总皂苷可显著改善小鼠脑缺血再灌注模型的脑缺血状况，具有抗脑缺血损伤的作用。

毛冬青总皂苷；脑缺血再灌注；神经细胞

毛冬青为冬青科冬青属植物IlexpubescensHook.et Arn.的干燥根，具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒之功效，生于山坡灌木丛中，是我国南方常用中药。临床上广泛用于治疗冠心病、缺血性脑中风、心绞痛、脉管炎、中心性视网膜炎、扁桃体炎、咽喉炎、小儿肺炎等，具有较好的疗效[1]。本实验通过复制小鼠脑缺血再灌注模型，观察毛冬青总皂苷对小鼠脑缺血再灌注后炎症介质及炎症因子、脑组织能量代谢、脑部组织形态学的影响，探讨其脑保护作用的特点及可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要药品及试剂

毛冬青(总皂苷含量为51%，批号20100312；河南中医学院分析化学实验室提供)、银杏叶提取物片(金纳多，德国威玛舒培博士药厂生产，批号0601209)、尼莫地平(山东新华制药股份有限公司生产，批号0808170)。 考马斯亮兰检测试剂盒(批号20100626)、ATP(Adenosine- triphosphate)检测试剂盒(批号20100613)、NO(Nitric oxide)检测试剂盒(批号20100626)、NOS(Nitric oxide synthetase)检测试剂盒(批号20100626)均由南京建成生物工程研究所生产。

1.2 仪器

UV- 2000紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司生产)，TGL- 16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂生产)，JA1 103 N电子分析天平(奥豪斯(上海)公司生产)，DZKW- 4型电子恒温水浴锅(北京永光明医疗仪器厂生产)，DY89- 1型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技有限公司生产)，可调式移液器(上海雷勃分析仪器有限公司生产)，2200H型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司生产)。

1.3 动物

昆明种雄性小鼠119只，体质量(28～32) g，河北省实验动物中心提供(合格证号1006019，实验室合格证号SYXK(豫)2010- 001)。

1.4 造模与给药

119只小鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、尼莫地平组、金纳多组、毛冬青总皂苷大、中、小剂量组7组，每组17只。除假手术组外，其余6组造小鼠短暂脑缺血再灌注模型。大、中、小剂量毛冬青总皂苷(300 mg/kg、150 mg/kg、75 mg/kg，用0.1%羧甲基纤维素钠(CMC)，分别配成浓度30 mg/ml、15 mg/ml、7.5 mg/ml的混悬液，体积0.1 ml/10 g)、金纳多组(阳性对照药，给药剂量为40 mg/kg，用0.1%CMC配成4 mg/ml的混悬液，体积0.1 ml/10 g)、尼莫地平组(阳性对照药，给药剂量为40 mg/kg，用0.1%CMC配成4 mg/ml的混悬液，体积0.1 ml/10 g)、模型组(灌服同体积0.1%CMC)，每天给药1次，连续给药10 d。于第10天(禁食12 h)给药后1 h，10%水合氯醛0.03 ml/10 g腹腔注射麻醉(小鼠的翻正反射消失)、备皮，酒精消毒颈部，手术刀作颈部正中切口，逐渐分离周围肌肉至双侧颈总动脉(CCA)，再用弯头小镊子剥离周围神经分离CCA，每个动脉用直径约为0.3 mm的针灸针钩起，使其约90°，缺血10 min，恢复灌流10 min，再缺血10 min，恢复供血并缝合小鼠。假手术组除不阻断CCA外，其他操作同造模各组。

1.5 取材与指标检测

所有小鼠再灌注24 h后眼眶取血测血液流变学，然后脱颈椎处死迅速取脑，矢状切取4%多聚甲醛0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)固定，用于HE染色。另一半在滤纸上吸净血迹准确称重，根据称重结果计算加入的冰生理盐水量，以脑组织(g)：生理盐水(ml)=1∶9比例制成10%的脑匀浆，4 ℃3000 r/min离心10 min，取上清液于-20℃以下低温保存。按照试剂盒说明书分别测定NO、NOS酶、Na+- K+- ATP酶、Mg2+- ATP酶及Ca2+- ATP酶含量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠脑匀浆NO、NOS、ATP酶含量比较

表1显示，与假手术组比较，模型组小鼠脑组织NO含量、tNOS、iNOS活力显著升高(P<0.01)，Na+- K+- ATP酶、Ca2+- ATP酶、Mg2+- ATP酶的活力显著降低(P<0.01)，说明造模成功。与模型组比较，尼莫地平组、金纳多组、大、中剂量毛冬青总皂苷均能显著降低NO含量和tNOS、iNOS活力，显著升高Na+- K+- ATP酶、Ca2+- ATP酶及Mg2+- ATP酶活力(P<0.01)，毛冬青总皂苷小剂量组iNOS活力明显降低(P<0.05)，Na+- K+- ATP酶、Ca2+- ATP酶活力明显升高(P<0.05)，表明毛冬青总皂苷对小鼠脑缺血再灌注损伤脑组织中NO以及NOS活力变化均有明显改善作用。并可通过提高实验小鼠脑组织的ATP酶活力，改善脑部能量代谢，对脑缺血再灌注损伤有较好的改善作用。从各组小鼠死亡情况可以看出，模型组死亡率高于用药各组，且大剂量组毛冬青总皂苷的死亡率最低，说明用药各组对缺血再灌注小鼠有一定的保护作用。

表1 各组小鼠脑匀浆中NO、NOS、ATP酶含量比较

注：与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，△△P<0.01

2.2 各组小鼠脑海马区与皮质区神经细胞病理变化比较

图1显示，假手术组小鼠海马区脑神经细胞未见异常病理改变，细胞核内染色质蓬松，核仁清晰；模型组小鼠脑海马区神经细胞出现水肿和溶解现象，细胞核模糊；尼莫地平组、金纳多组、高剂量、中剂量毛冬青总皂苷组小鼠脑海马区少数神经细胞出现轻度萎缩，部分神经细胞浆与核模糊不清，个别神经胶质细胞萎缩而淡染；小剂量毛冬青总皂苷组小鼠脑海马区部分神经细胞轻度萎缩及轻度水肿，胞浆与胞核模糊不清。

图1 各组小鼠脑组织海马区HE染色(HE×40)

图2显示，假手术组小鼠大脑皮质区神经细胞未见异常病理改变，神经细胞、神经胶质细胞均正常；模型组小鼠大脑皮质区脑神经细胞出现明显水肿、萎缩或消失；尼莫地平组、金纳多组、大剂量、中剂量毛冬青总皂苷组大脑皮层的少数神经细胞轻度水肿，细胞核较清晰，胶质细胞基本正常。小剂量毛冬青总皂苷组大脑皮层神经细胞胞浆与胞核模糊不清，神经胶质细胞淡染、萎缩及固缩。

图2 各组小鼠脑组织皮质区HE染色(HE×40)

表2显示，经Ridit检验与假手术组比较，模型组小鼠大脑海马区及皮质区神经细胞出现显著病理变化(P<0.01)，说明造模成功。与模型组比较，大、中剂量毛冬青总皂苷组、金纳多组和尼莫地平组均可明显减轻小鼠大脑海马区、皮质区神经细胞出现的病理变化(P<0.05)，小剂量毛冬青总皂苷组对小鼠大脑皮质区神经细胞有明显的改善作用(P<0.05)，而对小鼠大脑海马区神经细胞出现的病理变化仅有减轻趋势。

3 讨论

脑缺血- 再灌注损伤是一定条件下，缺血脑组织恢复血液供应后出现了更加严重的脑功能障碍和结构损伤，常见于休克、脑血管栓塞再通、心肺脑复苏等。缺血性脑血管病的发病率、致残率、复发率、死亡率都很高，随着我国人口老龄化进程加快，预计脑血管病的发病率在今后将继续升高，其危害也会越来越严重[2]。

现代医学对脑缺血的治疗主要采用溶栓药或降纤酶类药物[3]，以恢复缺血区的血液供应，但同时也带来了再灌注损伤，故抑制再灌注损伤已成为治疗缺血性脑血管疾病的重要环节。近年来，中医药防治脑缺血- 再灌注损伤的研究发展迅速，中医认为应将其归为缺血中风范畴，主要与风、火、瘀、痰、虚等因素有关。缺血性中风发生后，往往由于“瘀阻脑络”而与瘀关系最为密切，因此大多数学者主张使用以“活血化瘀”改善微循环为主的治则来治疗本病[4- 6]。有学者[7-8]提出“毒邪”和“络病”可作为深入研究的切入点，无疑是对中风发病理论的新思考。基于“既往”兼于“现代”提出用清热解毒合并活血化瘀法治疗脑缺血，解毒以祛除损害因素，通络以畅通气血渗灌，从而恢复脑神经的正常功能。毛冬青具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒之功效，研究表明毛冬青对脑血管具有一定的扩张作用，这对促进脑循环、调整脑血流量、防治脑血管疾病具有一定帮助[9]。冬青总黄酮、总皂苷都是从冬青属植物毛冬青的干燥根中提取出来的有效成分之一，前期研究已对毛冬青总皂苷摸索出比较成熟的提取工艺[10]。

表2 各组小鼠脑海马区与皮质区神经细胞病理变化结果

注：“-”：神经细胞基本正常；“+”：少数神经细胞出现轻度萎缩；“++”：部分神经细胞出现中度萎缩伴少数细胞轻度水肿；“+++”：全部神经细胞出现重度萎缩或伴部分细胞中度水肿

脑缺血时，细胞膜去极化引起Ca2+内流，促使细胞内Ca2+超载，Ca2+超载又会激活磷脂酶A2，使膜磷脂降解，膜磷脂降解可引起ATP酶活性降低。缺血所诱导的iNOS蛋白及mRAN上调，导致iNOS活力增强及NO生成增多。在脑缺血的晚期，NO对血管不再具有保护效应，相反iNOS所生成的绝大多数NO在这个时期被认为具有神经毒性[11]。用药物阻断iNOS能减少30%的梗死体积；iNOS基因敲除大鼠同野生大鼠比较，其梗死体积较少，神经功能预后较好。

本实验结果表明，小鼠脑缺血再灌注模型复制成功，毛冬青总皂苷可显著降低脑匀浆中的NO水平和NOS活力，升高脑匀浆中ATP酶活力，并显著减轻脑组织海马区和皮质区神经细胞的损伤，均以大剂量、中剂量为优。提示毛冬青总皂苷可通过抑制缺血后炎症反应，改善炎症引起的一系列级联反应介质和细胞因子，减少脑缺血再灌注损伤后因氧供需失衡和糖代谢紊乱引起的神经细胞凋亡，从而达到抗脑缺血损伤的作用。

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Effect of Total Saponins of Mao Dong Qing On Cerebral Ischemia Reperfusion Model in Mice

CAO Li- hua， LIU Rui- li, MIAO Ming- San△

(Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China)

Objective:To explore the action characters of total Saponin from Radix Ilex Pubescens on Cerebral Ischemia- reperfusion injury and its mechanism. Methods: The mice were randomly divided into 7 groups, The sham operation group, Model group, Nimodipine group, Ginaton group, Large, medium and small dose of total Saponin from Radix Ilex Pubescens. Firstly by using the method of blocking the bilateral common carotid artery(CCA)10 minutes,restore perfusion 10 minutes,and then Bilateral carotid artery occlusion 10 minutes.After the last administration and then reperfusion 24 hours.To discuss the protection of saponin from Radix Ilex Pubescens for Cerebral Ischemia- reperfusion injury. The activity of nitricoxide synthase(NOS)and the level of nitrogen monoxidum (NO),the content of SOD and MDA. The morphological changes of brain tissue were observed. Results:The models with cerebral ischemia- reperfusion injury in mice were copied successfully, The activity of NOS and the content of NO were increased significantly and the ATP were lowerd significantly of the animals brain in surgical model, Reduce nerve cell injury histopathology.The better group is high dose and medium dose. Conclusion:The Saponin of Radix Ilex Pubescentis show protective effect on improving cerebral ischemic conditions of Cerebral Ischemia- reperfusion mice.

Saponin of Radix Ilex Pubescentis; Cerebral Ischemia reperfusion; nerve cell

国家“重大新药创制”科技重大专项(2009ZX09103- 324)；河南省优秀科技创新团队(TCJ2014- 391)；郑州市科技创新团队(131PCXTD612)

曹利华(1989-)，女，河南商丘人，医学博士，从事分子药理学研究。

R285.5

B

1006- 3250(2017)07- 0928- 03

2017- 01- 23

△通讯作者：苗明三，男，教授，医学博士，从事中药药理教学与研究，E- mail:miaomingsan@163.com。