益气健脾法对人胃癌MGC803细胞增殖及凋亡的影响①

郭隽馥 王 丹 丛培玮 苗兰英

(辽宁中医药大学教学实验中心，沈阳110847)

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。尽管在过去的几十年中胃癌的总体发病率有所下降，但在全球范围内其发病率和死亡率仍不可小觑，分别位居各种恶性肿瘤的第5位和第3位[1]。因此，寻找胃癌治疗的有效药物并探究其潜在的作用机制，具有重要的科学意义和广泛的经济学效应。最新的统计显示，在非发达国家地区胃癌的死亡率居男性肿瘤患者之首[1]。我国是胃癌的高发国家，发病率及死亡率均高于世界平均水平。因此，深入研究胃癌发生进展的分子机制，具有重要的科学意义和潜在的应用价值。

近年来大量研究表明，中医药在延长恶性肿瘤患者生存期、改善其生存质量及预防肿瘤复发和转移等方面发挥重要作用[2-4]。《脾胃论》中有书:“内伤脾胃，百病由生”。这提示，脾胃功能状态与各种疾病的产生密切相关。若脾胃功能强健，正气旺盛，则难罹疴疾；反之，脾胃虚弱，运化失司，气血无以生化，正气逐渐降低，则易感受邪气而发生胃癌[5]。陆喜荣等[6]的研究结果显示，在胃癌的早期即可出现脾气虚弱的症状，并且脾虚贯穿于胃癌进展的各个阶段。可见，益气健脾法可作为中医治疗胃癌的常用疗法。

四君子汤、补中益气丸、参苓白术散，是健脾益气的基础方，具有“调补正气，扶正固本，适应原样”的作用[7]。大量研究表明，四君子汤对肺癌、大肠癌、卵巢癌等均有疗效[8-10]，并且具有安全、毒副作用少等特点。沈克平等[11]应用胃肠安方(组方为四君子汤加减)对148例胃癌术后病例进行随机分组对照研究，结果显示中药组胃癌术后1、2、3年生存率明显高于化疗组，中药组术后1年的转移率亦呈最低，提示四君子汤加减的应用可能对胃癌术后复发具有抑制或延缓作用。本研究应用益气健脾方药——四君子汤的含药血清处理胃癌细胞，以期从影响肿瘤细胞生长的角度探讨益气健脾法治疗胃癌的潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 20只SPF级雄性SD大鼠，体重(280±20)g，购于本溪实验动物中心。饲养于辽宁中医药大学实验动物中心，室温18～23℃，相对湿度45%～55%，自由饮水进食，经在实验动物中心适应性饲养1周后，开始实验。DMEM培养基和双抗试剂均购于Invitrogen公司；胎牛血清购于依科赛公司；Trizol和Real-time PCR试剂盒均购于TaKaRa公司；细胞培养瓶和培养板购于康宁公司；Cell Counting Kit-8试剂和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；益气健脾中药四君子汤成分:人参、白术、茯苓、甘草购于辽宁省中医院门诊药局；人胃癌MGC803细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会。

1.2方法

1.2.1四君子汤含药血清的制备 常规方法煎出四君子汤药液200 ml，浓缩至100 ml，以10 ml/瓶分装，高压灭菌0.1～0.15 KPa、15 min，4℃保存备用。实验大鼠随机分为2组:对照组10只，益气健脾组 10 只。对照组每日灌胃给予生理盐水1 ml/100 g，益气健脾组每日灌胃给予四君子汤煎剂1 ml/100 g，1次/d，共7 d。第7天灌胃给药1.5 h后腹主动脉取血，室温静置2 h后，3 000 r/min 离心15 min分离血清，56℃水浴30 min 灭活,0.22 μm微孔滤膜过滤，-80℃冷冻保存。

1.2.2细胞培养 复苏后的MGC803细胞接种于25 cm2培养瓶中，加入含10%胎牛血清和100 U/ml双抗的DMEM培养液，置于37℃、饱和湿度5%CO2培养箱中孵育，2～3 d细胞汇合率达80%后，常规胰酶消化传代。

1.2.3CCK-8细胞增殖检测 实验分组为空白对照组、15%对照血清组和15%益气健脾血清组。取生长状态良好的MGC803细胞，接种于96孔细胞培养板中，5×103～8×103个/孔，每组3个复孔。12～24 h后(汇合度达50%～70%)，更换为无血清DMEM培养基饥饿培养。饥饿6 h后空白对照组、15%对照血清组和15%益气健脾血清组分别更换为含15%胎牛血清、含15%对照组血清以及含15%益气健脾组血清的DMEM培养基培养。分别在加药处理24、48和72 h后，弃含药培养基，PBS洗1次，每孔加入含10% CCK-8的DMEM完全培养基，置于细胞培养箱内继续孵育1 h，酶标仪测定450 nm波长OD值。实验重复3次。

1.2.4流式检测细胞凋亡 实验分组为空白对照组、15%对照血清组和15%益气健脾血清组。取生长状态良好的MGC803细胞，接种到6孔细胞培养板中，2×105～3×105个/孔。12～24 h后(融合度达50%～70%)，更换为无血清DMEM培养基饥饿培养。饥饿6 h后空白对照组、15%对照血清组和15%益气健脾血清组分别更换为含15%胎牛血清、含15%对照组血清以及含15%益气健脾组血清的DMEM培养基培养。在加药处理72 h后，采用不含EDTA的胰酶消化各组细胞，收集细胞。 PBS轻洗细胞1次，加入200 μl 1 × Binding Buffer重悬细胞，再向细胞悬液中加入5 μl Annexin V-FITC及10 μl PI，混匀后室温避光孵育15 min。PBS轻洗细胞2次后送检分析，实验重复3次。

1.2.5Real-time PCR检测Caspase3和Bax mRNA表达水平 实验分组为空白对照组、15%对照血清组和15%益气健脾血清组。加药处理72 h后收集各组细胞，按Trizol试剂说明书的方法提取细胞总RNA。应用TaKaRa反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA第一链。逆转录成cDNA后，以GAPDH为内参，Real-tine PCR检测Caspase3和Bax mRNA表达水平，反应条件为95℃预变性30 s，95℃变性5 s、60℃退火及延伸34 s、进行45个循环，每个样品设置3个复孔，在AB I7500实时定量PCR系统上进行，实验重复3次。Caspase3引物序列:上游为5′-ATGACATCTCGGTCTGGT3′，下游为5′-AGAAACATCACGCATCAA-3′；Bax引物序列:上游为5′-CAGAGGCGGGGGATGATTG-3′，下游为5′-TGTCCAGCCCATGATGGTTC-3′；GAPDH序列[12]:上游为5′-GGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游为5′-GGAAGAT- GGTGATGGGATT-3′。

2 结果

2.1益气健脾法对人胃癌MGC803细胞的增殖能力的影响 CCK-8检测结果(图1)显示，与空白对照组及15%对照血清组相比较，15%益气健脾血清组细胞的增殖能力在48 h和72 h均有明显地下降趋势(P<0.05)。可见，益气健脾法能有效抑制人胃癌细胞MGC803细胞的增殖能力。

2.2益气健脾法对人胃癌MGC803细胞凋亡情况的影响 采用含15%益气健脾组血清的DMEM培养基培养MGC80细胞72 h后，检测细胞凋亡情况(图2)。各组凋亡率分别为:空白对照组(8.32±2.73)%，15%对照血清组(8.07±2.46)%，15%益气健脾血清组(16.38±0.84)%。与空白对照组及15%对照血清组相比较，15%益气健脾血清组细胞的凋亡率均显著增加(P<0.01)。

图1 加药处理后MGC803细胞的增殖情况Fig.1 Proliferation of MGC803 cells 72 h after drug treatmentNote: *.P<0.05，48 h and 72 h 15% benefiting qi and strengthening spleen group vs control group or 15% control serum group.

图2 加药处理72 h后MGC803细胞凋亡情况Fig.2 Apoptosis of MGC803 cells 72 h after drug treatment

图3 加药处理后各组MGC803细胞中Bax和Caspase3 mRNA的相对表达水平Fig.3 Relative expression level of Bax and Caspase3 mRNA in MGC803 cells after drug treatmentNote: *.P<0.05,**.P<0.01，15% benefiting qi and strengthening spleen group vs control group or 15% control serum group.

2.3益气健脾法对人胃癌MGC803细胞中Bax和Caspase3 mRNA表达的影响 加药处理72 h后，与空白对照组相比较，15%益气健脾血清组MGC803细胞中Bax和Caspase3 mRNA含量均显著下调(P<0.01)。同时发现，Bax在15%益气健脾血清组细胞中的表达水平显著低于15%对照血清组(P<0.01)，Caspase3在15%益气健脾血清组细胞中的表达水平也低于15%对照血清组(P<0.05)。提示，益气健脾法能有效抑制MGC803细胞中Bax和Caspase3基因的表达。

3 讨论

中医治疗恶性肿瘤主要采用扶正解毒抗癌法。脾气虚胃癌患者常伴有食欲不振、面色不华、苔薄、脉细、食后饱胀、倦怠乏力、便溏、泄泻等症状。临床上则常应用益气健脾方药治疗上述症状。四君子汤、参苓白术散、补中益气汤是益气健脾法的常用方药。益气健脾方药的运用，在改善症状、防止病情恶化、延长患者的生存期、减轻放化疗毒副作用方面收效显著，明显提高了患者的生存质量[5]。

为了探究益气健脾法治疗胃癌的潜在作用机制，我们应用益气健脾法经典方药——四君子汤的含药血清处理人胃癌MGC803细胞，观察其对细胞增殖能力的影响。CCK-8增殖实验检测结果显示，与空白对照组及15%对照血清组相比较，15%益气健脾组血清加入细胞48 h乃至72 h后，细胞的增殖能力均显著下降。与此类似，徐云丹等[13]研究发现，采四君子汤含药血清与5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)联用能显著抑制结肠癌HT-29细胞的生长，且高剂量四君子汤血清与5-FU合用组细胞生长抑制率显著高于5-FU单用组。此外，研究发现，四君子联合小柴胡汤对肝郁脾虚型移植性原发性肝癌小鼠有明显的抑瘤作用，其作用机制主要是诱导肝癌细胞凋亡[14]。课题组前期研究表明，采用四君子丸含药血清处理人肺癌SPCA1细胞48 h后，细胞的凋亡率明显增加，细胞中Caspase3/7/9 mRNA表达水平显著上调[8]。在本研究中，经流式细胞仪检测发现，与空白对照组和15%对照血清组相比较，15%益气健脾血清组细胞的凋亡率均显著增加。

然而，四君子汤如何影响胃癌细胞的生长，其潜在的作用机制如何。细胞凋亡是细胞在各种死亡信号刺激后发生的一系列瀑布式的主动性死亡过程，受多种基因调控。研究资料显示，大部分的凋亡都与Caspase家族和Bcl2家族密切相关[15，16]。因此，我们选择了Caspase家族中最重要的凋亡执行者Caspase3以及Bcl-2家族中具有促进凋亡作用的Bax作为检测指标以探究细胞是否已进入了凋亡过程中的不可逆阶段[17，18]。Real-time PCR检测结果显示，与空白对照组及15%对照血清组相比较，15%益气健脾血清组细胞中Caspase3和Bax mRNA的表达水平均显著下调。此外，四君子汤抑制胃癌细胞生长的深层机制以及此方药中各个成分的具体作用机制有待我们进一步研究。

综上所述，益气健脾方药四君子汤的含药血清能够有效抑制胃癌MGC803细胞的增殖能力并提高其凋亡率。此外，经四君子汤含药血清处理后细胞中凋亡促进基因Bax和Caspase3的表达水平均明显增加。提示，益气健脾方药可以有效抑制胃癌细胞增殖并促进其凋亡，这可能是其治疗胃癌的潜在机制。