维生素E对抗环磷酰胺对肾小管上皮细胞的毒性作用

高金祥　刁汇玲　王雅宁　董　华　张晓敏　吕　敏　贾振华　刘益涛

1　滨州医学院附属医院肾内科　滨州　256603；2 滨州医学院基础医学院生理学教研室



维生素E对抗环磷酰胺对肾小管上皮细胞的毒性作用

高金祥1刁汇玲2王雅宁1董华1张晓敏1吕敏1贾振华1刘益涛1

1滨州医学院附属医院肾内科滨州256603；2 滨州医学院基础医学院生理学教研室

【摘要】目的研究维生素E抑制环磷酰胺所致肾小管上皮细胞毒性作用的影响。方法通过MTT和中性彗星实验，分别观察环磷酰胺单独或与维生素E联合应用时对肾小管上皮细胞生存率及DNA损伤的作用。结果与对照组相比，1、3 mol/L环磷酰胺处理肾小管上皮细胞12 h后可显著降低细胞生存率，并可造成细胞的DNA损伤(P<0.05)；与环磷酰胺处理组相比，1 mmol/L维生素E显著降低了环磷酰胺致肾小管上皮细胞DNA损伤的作用(P<0.05)，但对环磷酰胺降低肾小管上皮细胞生存率的作用无明显影响(P>0.05)。结论维生素E对抗环磷酰胺致肾小管上皮细胞DNA损伤的作用。

【关键词】环磷酰胺；维生素E；肾小管；上皮细胞

近年来环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)在临床上广泛应用于对激素依赖或对激素抵抗的肾病综合征、狼疮性肾炎等肾脏疾病[1，2]的治疗。它在杀伤免疫细胞的同时，还降低了正常组织细胞的抗氧化能力，促进自由基过量生成，以致于正常细胞发生氧化应激反应，因此寻求一个既能降低其副作用又不减低疗效的方法已成为当务之急。维生素E(vitamin E，VE)又称生育酚，是临床上常用的抗氧化药物，可以清除自由基，阻断脂质过氧化，保护细胞和组织免受由自由基诱导的氧化损伤[3，4]。因此，VE与CTX联合应用极有可能降低了CTX对正常肾组织细胞的损伤作用。本研究应用MTT实验和中性彗星实验，观察了VE对CTX所诱发的正常肾小管上皮细胞毒性效应的保护作用，旨在为提高CTX药用价值提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器人类肾小管上皮细胞株(HKC)，购自美国ATCC细胞库；小牛血清及RPMI 1640购于Gibco公司；噻唑蓝(MTT)和CTX购自sigma公司；Leica 倒置荧光显微镜(德国LEICA公司)；ELX-800酶标仪(美国Bio-TEK公司)；DYY-6D型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.2MTT实验将2×107L-1 HKC悬液以200 /孔接种于96孔板，实验分为对照组(0 mol/L CTX)、0.1、0.3、1、3、10 mol/L CTX处理组，每组有5个复孔。细胞孵育6、12和24 h后，用酶标仪测吸光度值(A490nm)，进而计算细胞存活率[5]。

1.3中性彗星试验HKC经CTX处理后，细胞浓度调为6×1010L-1，制成三明治胶。用4?C细胞裂解液浸泡三明治胶内细胞2 h，然后移至电泳槽内，电泳30 min后镜下观察，comet score 软件分析实验结果[5]。

1.4统计学方法所有实验数据采用SPSS软件进行单因素方差分析，并进行t检验。

2结果

2.1不同浓度CTX对HKC存活率的影响如表1所示，与对照组相比，0.1 mol/L CTX对HKC无明显毒性作用(P>0.05)；0.3 mol/L CTX处理细胞24 h后有较明显的毒性作用(P<0.05)；1 mol/L CTX处理细胞12、24 h后，细胞存活率分别降为(87±7.42)%、(81±6.13)%；3、10 mol/L CTX在各个时间段都能明显降低HKC的存活率(P<0.05)。据以上实验结果得出，CTX对HKC存活率的影响具有时间、剂量效应。本研究选出1、3 mol/LCTX作用细胞12 h进行后续实验。

表1　不同浓度CTX对HKC存活率的影响

注：与对照组相比，*P<0.05

2.2VE联合CTX对HKC生存率的影响1和3 mol/L CTX处理HKC 12 h后，细胞存活率与对照组相比明显下降(P<0.05)，但VE与CTX联合应用后，细胞存活率比单独应用CTX无明显变化(P>0.05)，这表明1 mmol/L VE不能显著减低CTX对HKC的细胞毒性，见表2。

表2　VE降低了CTX对HKC生存率的抑制作用

注：与对照组相比，*P<0.05；与CTX处理组相比，#P<0.05

2.3VE联合CTX对细胞DNA损伤的影响如表3和图1所示，1、3 mol/L CTX处理HKC 12 h后，彗尾长度和有尾细胞百分比与对照组明显增加。CTX与1 mmol/L VE联合应用时，彗尾的长度和有尾细胞百分比与CTX处理组相比明显变短，但仍长于对照组(P<0.05)，这表明VE降低了CTX对细胞DNA的损伤。

表3　VE降低了CTX损伤细胞DNA的作用

注：与对照组相比，*P<0.05；与CTX处理组相比，#P<0.05

3讨论

环磷酰胺是一种烷化剂，在杀伤肿瘤细胞的同时还具有免疫抑制的作用，因此在肾脏疾病的治疗中得到了广泛的应用。它进入体内后可转化为酰胺氮芥和丙烯醛，后者可破坏正常细胞氧化-抗氧化平衡系统，所产生的自由基作用于DNA的脱氧核糖和碱基，导致DNA双链断裂及交联[6]。抗氧化剂VE是否具有保护正常的肾脏组织免受CTX损伤的作用，成为本研究所关注的热点。

本研究通过MTT实验观察到CTX对HKC的毒性作用具有时间和剂量效应。1、3 mol/L CTX处理细胞12 h后，HKC细胞存活率分别下降为(87±7.42)%、(85±5.23)%，与对照组相比具有显著差异性。但是1、3 mol/L CTX与1 mmol/L VE联合处理细胞时，细胞存活率与CTX单独处理细胞

无明显差异，这表明VE不能拮抗CTX对HKC的杀伤作用。

中性彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，它能根据相同的电泳条件下迁移的DNA量(有尾细胞百分比)和DNA迁移部分的迁移长度(彗尾长度)来测定单个细胞DNA损伤程度[7]。本研究通过中性彗星实验发现，1、3 mol/L CTX可导致HKC发生DNA损伤，1mmol/LVE降低了CTX对DNA的损伤，但是不能完全抑制CTX的损伤作用，这提示了VE可部分拮抗了CTX对HKC造成的DNA损伤作用。

综上所述，VE可保护了正常的肾组织细胞免受CTX所诱导的细胞DNA损伤，其作用机制可能是VE作为脂溶性抗氧化剂，清除了CTX处理HKC后所产生的自由基和脂质过氧化物，降低了后者所造成的细胞DNA损伤，但VE具体的作用机制还需要进一步探讨。

参考文献

[1] Larkins N,Kim S,Craig J,et al.Steroid-sensitive nephrotic syndrome:an evidence-based update of immunosuppressive treatment in children[J].Arch Dis Child,2015,pii: archdischild-2015-308924.[Epub ahead of print]

[2] Tian S Y,Feldman B M,Beyene J,et al.Immunosuppressive Therapies for the Maintenance Treatment of Proliferative Lupus Nephritis:A Systematic Review and Network Metaanalysis[J].J Rheumatol,2015,42(8):1392-1400.

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[7] Olive P L,Banáth J P.Growth fraction measured using the comet assay[J].Cell Prolif,1992,25(5):447-457.

Vitamin E inhibits the toxic effects of cyclophosphamide on human kidney tubular epithelial cell

GAO Jinxiang1DIAO Huiling2WANG Yaning1DONG Hua1ZHANG Xiaomin1LYU Min1JIA Zhenhua1LIU Yitao1

1 Department of Nephrology,Binzhou Medical University Hospital,Binzhou 256603,P.R.China;2 Department of Physiology,School of Basic Medical Sciences,Binzhou Medical University

【Abstract】ObjectiveTo study the inhibitory action of vitamin E for the toxic effects of cyclophosphamide (CTX) on human kidney tubular epithelial cells (HKCs).MethodsMTT assay and neutral comet assay were separately used to observe the effect of CTX alone and in combine with vitamin E on the survival rate and DNA damage of HKCs.ResultsAfter 12h treatment, 1,3 mol/LCTX inhibited proliferation of HKCs and induced DNA damage of HKC (P<0.05) in comparison with control group.Compared with CTX treated group,Vitamin E decreased DNA damage induced by CTX (P<0.05).In addition,VE didn't change the HKC death induced by CTX (P>0.05).ConclusionsVE could inhibit the DNA damage of HKC induced by CTX.

【Keywords】cyclophosphamide,vitamin E,kidney tubule,epithelial cell

(收稿日期：2016-02-23 )

【中图分类号】R692

【文献标志码】A

【文章编号】1001-9510(2016)02-0109-03

基金项目：滨州医学院校级科技计划(BY2009KJ38)

高金祥,E-mail：gjx751012@163.com