丹参通络解毒汤对骨髓干细胞移植急性心肌梗死模型大鼠NF- κB介导的炎症反应影响❋

李鑫辉，李雅婧，黄淼鑫，许福丽，肖 青，郭晨鹤

(湖南中医药大学中医学院，长沙 410208)

【实验研究】

丹参通络解毒汤对骨髓干细胞移植急性心肌梗死模型大鼠NF- κB介导的炎症反应影响❋

李鑫辉，李雅婧，黄淼鑫，许福丽，肖 青，郭晨鹤

(湖南中医药大学中医学院，长沙 410208)

目的： 探讨丹参通络解毒汤对骨髓干细胞(BMSCs)移植急性心肌梗死(AMI)模型大鼠核因子- κB(NF- κB)介导炎症反应的影响。方法：80只大鼠按随机数字表法分为SH组(假手术组)、AMI组(模型组)、BMSCs组(BMSCs移植组)、DSTLJD组(丹参通络解毒汤组)、 DSTLJD+ BMSCs组(丹参通络解毒汤+ BMSCs移植)各10只，BMSCs细胞悬液直接注入梗死区边缘心肌组织，给予中药或生理盐水灌胃，4周后采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组大鼠血清肿瘤坏死因子- α(TNF- α)、白细胞介素- 6(IL- 6)的含量，免疫组化法观察心肌核因子- κB(NF- κB)蛋白表达，并用HE染色观察心肌组织形态病理变化。结果：与AMI组比较，BMSCs组、DSTLJD组、DSTLJD+ BMSCs组大鼠心肌NF- κB蛋白表达明显降低，且血清炎症因子TNF- α和IL- 6水平明显下降，差异有统计学意义，心肌损伤程度明显改善；DSTLJD+ BMSCs组优于单纯BMSCs组、单纯DSTLJD组，差异有统计学意义。结论：BMSCs移植联合丹参通络解毒汤能够改善AMI 模型大鼠的心肌损伤，减轻炎症反应，修复缺血心肌，其机制可能与调节 NF- κB 介导的炎症反应有关。

丹参通络解毒汤；急性心肌梗死；核因子- κB；白细胞介素- 6；肿瘤坏死因子- α；炎症反应

急性心肌梗死(AMI)是心血管疾病致死及致残的主要原因，且发病率逐年上升。近年来，骨髓间充质干细胞(BMSCs)因其取材方便、体外扩增能力强、可来源于自身等优势[1]，移植到缺血梗死部位，在心脏微环境的影响下可以分化为心肌细胞、血管内皮细胞等，进而促进心肌组织修复，调节梗死区域心肌细胞的凋亡，改善心脏功能，因而逐渐成为治疗AMI的新途径。同时有研究表明，中药能改善干细胞移植的微环境，对干细胞的动员、归巢、增殖和分化有优势互补、协同增效的作用[2- 3]。本研究的目的在于探讨丹参通络解毒汤联合BMSCs移植对AMI鼠核因子- κB介导炎症反应的影响。

1 实验材料

1.1 动物

4～6周幼龄SD大鼠20只用以提取骨髓间充质干细胞。SD大鼠80只，体质量200～250 g用以造AMI模型；喂养方式为普通饲料,自由饮食，12 h/12 h明暗环境交替，实验动物购自湖南中医药大学实验动物中心(许可证号SYXK(湘)2013- 0005)。

1.2 药物和主要试剂

NF- κB免疫组化试剂盒，中杉金桥生物有限公司；TNF- α、IL- 6 酶联免疫吸附试剂盒，武汉博士德有限公司。丹参通络解毒汤组成：丹参15 g，当归15 g，红花10 g，玄参15 g，檀香10 g，水蛭6 g，黄芪30 g，川芎10 g，黄芩10 g，栀子15 g，黄连6 g等)。浸泡、去渣，水煎浓缩至药液浓度0.35 g·ml-1(含生药)，于4 ℃冰箱保存备用，由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。

1.3 主要仪器

动物呼吸机DW- 2000型,上海嘉鹏科技有限公司；显微摄像系统Motic B5型，麦克奥迪实业集团公司；CO2培养箱Galaxy型，英国New Brunswick公司；多道生理信号采集处理系统RM- 6280型,成都仪器厂制造。

2 方法

2.1 BMSCs的制备和培养

采用全骨髓贴壁法结合密度梯度离心法进行分离培养。拉颈法处死,75%酒精中浸泡10～15 min,收集股骨髓腔中的细胞，加入含有15%胎牛血清的完全培养液中培养，经多次换液和消化后获得第三代BMSCs。鉴定方法：采用流式细胞仪检查细胞表面抗原，标准为CD34 阳性率低于5%，且CD90、CD44 阳性率高于95%，即可认为该细胞为高纯度的BMSCs[4]。

2.2 造模方法

大鼠用10%水合氯醛按照体质量250 g·ml-1腹腔麻醉后固定，记录标准II导联心电图。气管切开并连接动物呼吸机，打开胸腔暴露心脏，于左心耳下左冠状动脉前降支上1/3处穿线，在线两段各穿一结扎环以阻断冠脉血流。以心电图QRS波群增高增宽、ST段抬高、心肌颜色发绀为结扎成功[5- 6]。

2.3 分组及给药

80只大鼠按随机数字表法分为SH组(假手术组)、AMI组(AMI模型组)、BMSCs组(BMSCs移植组)、DSTLJD组(丹参通络解毒汤组)、 DSTLJD+ BMSCs组(丹参通络解毒汤+ BMSCs 移植组)5组各10只。除假手术组只穿线不结扎外，其余组行AMI术，并在造模成功后30 min，于心肌梗死区边缘心肌组织的3个位点直接注入共100 μL(含细胞数3×106)的BMSCs细胞悬液，假手术组和AMI组则注入100 μL的PBS缓冲液。术后连续14 d丹参通络解毒汤组与参通络解毒汤+ BMSCs 移植组分别灌胃丹参通络解毒汤10 ml·kg-1·d-1，余各组用等量生理盐水灌胃。

2.4 心肌组织病理改变的观察

处死大鼠取出心脏，用冰冷的生理盐水冲洗后，取缺血处心肌组织置于多聚甲醛中固定后，常规石蜡包埋切片，经HE染色后观察心肌组织的病理改变。

2.5 血清TNF- α、IL- 6水平检测

通过腹主动脉采集大鼠全血，离心后取血清用ELISA法测定，严格按试剂说明书进行操作。

2.6 心肌NF- κB蛋白表达检测

大鼠处死后，取心肌梗死区制作成切片，严格按照免疫组化试剂说明书操作。在光学显微镜下400倍放大拍照，每张切片在近梗死区随机观察5个视野，每组共50个视野，用彩色病理图像分析系统测量平均灰度。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 对心肌组织形态学观察结果

图1显示，HE染色结果显示，假手术组心肌组织未见明显的病理形态异常改变；AMI组大鼠心肌组织可以观察到心肌细胞变性、坏死，肌束排列不整齐，心肌间质有大量炎性细胞浸润，细胞明显肿胀，病理学改变较为明显；BMSCs移植组和DSTLJD组大鼠心肌细胞有炎性细胞浸润，细胞肿胀轻度，肌束紊乱程度较轻，且肿胀及肌束紊乱程度较AMI组明显改善；DSTLJD+ BMSCs组肌束排列较整齐，细胞肿胀轻度，炎性细胞浸润改善，细胞溶解情况减少。

图1 各组大鼠心肌病理形态比较(HE染色 ×400)注：A.SH组； B.AMI组； C.BMSCs组； D. DSTLJD组； E.DSTLJD+BMSCs组

3.2 丹参通络解毒汤对大鼠血清TNF- α、IL- 6的影响

表1显示，与AMI组比较，BMSCs组、DSTLJD组和DSTLJD+ BMSCs组TNF- α、IL- 6水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；BMSCs组与DSTLJD组比较，TNF- α、IL- 6水平比较差异无统计学意义；与BMSCs组和DSTLJD组比较,DSTLJD+ BMSCs组TNF- α、IL- 6水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。研究显示，丹参通络解毒汤可以明显降低TNF- α、IL- 6水平，当联合BMSCs移植时效果更强。

表1 丹参通络解毒汤对大鼠血清TNF- α、IL- 6水平的影响

注：与SH组比较：*P<0.05，**P<0.01；与AMI组比较：#P<0.05，##P<0.01；与BMSCs组比较：△P<0.05，△△P<0.01；与DSTLJD组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.3 丹参通络解毒汤对心肌NF- κB蛋白表达的影响

表2图2显示，与AMI组比较，BMSCs组、DSTLJD组和DSTLJD+ BMSCs组大鼠心肌NF- κBp65蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；BMSCs组与DSTLJD组比较，大鼠心肌NF- κBp65蛋白表达差异无统计学意义；与BMSCs组和DSTLJD组比较, DSTLJD+ BMSCs组大鼠心肌NF- κBp65蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。研究显示，丹参通络解毒汤可以明显降低大鼠心肌NF- κBp65蛋白表达，当联合BMSCs移植时效果更强。

表2 丹参通络解毒汤对心肌NF- κB蛋白表达平均灰度比较(平均灰度

注：与SH组比较：*P<0.05，**P<0.01；与AMI组比较：#P<0.05，##P<0.01；与BMSCs组比较：△P<0.05，△△P<0.01；与DSTLJD组比较：▲P<0.05；▲▲P<0.01

图2 各组大鼠NF- κBp65蛋白表达的免疫组化染色检测(SP×400)注：A.SH组； B.AMI组； C.BMSCs组； D.DSTLJD组； E.DSTLJD+BMSCs组

4 讨论

心肌梗死后，由于组织缺血缺氧等因素激活自身病理性免疫炎症调节系统，诱导心肌组织细胞坏死、凋亡等梗死后效应。机体为清除坏死细胞又进一步激活炎症反应，从而导致心肌组织损伤加重[7- 8]。BMSCs作为一种存在于骨髓组织中具有自我增殖及能分化为心肌组织细胞、血管内皮细胞潜能的多能干细胞。有研究显示，BMSCs不仅具有独特的免疫学特性，还能在移植后宿主体内存活并对AMI后病理性免疫反应起到一定的调节作用[9]。然而组织缺血、缺氧损伤发生后会出现相应的炎症反应及病理变化,造成缺血损伤微环境对BMSCs存活率产生影响。有研究表明，中药干预BMSCs可为BMSCs移植提供良好的微环境作用，可促进BMSCs的归巢、定植以及分化，为BMSCs移植提供良好的微环境，从而提高移植后的成活率，对缺血心肌保护作用具有增强促进作用[10]。

NF- κB是介导炎症因子释放的关键性转录因子，正常生理状况下，其以无活性状态与抑制性蛋白IκB结合以同源二聚体形式存在，当多种病理因素刺激时，NF- κB与IκB解体而被磷酸化激活，进而调控靶基因转录，释放相关炎症因子，如IL- 6、TNF- α等[11]。同时TNF- α、IL- 6等物质的释放不仅能损伤心肌细胞，还可以通过机体反馈作用维持NF- κB的活性，使心肌损伤不断加重。本实验结果显示，干细胞移植和丹参通络解毒汤都可以明显抑制AMI炎症反应，减少心肌NF- κB蛋白表达，降低TNF- α、IL- 6水平，改善心肌病理形态，且两者保护作用相当；而丹参通络解毒汤联合干细胞移植对心肌保护作用最强，两者具有相互促进作用。因此我们推测丹参通络解毒汤保护心肌的重要机理之一，可能是处方改善BMSCs移植、增殖、分化的微环境，增加BMSCs归巢量，通过细胞的旁分泌作用，促使干细胞分泌一些有益细胞因子，降低心肌NF- κB蛋白表达，从而降低血清TNF- α、IL- 6水平，抑制急性心肌梗死后炎症反应进而保护心肌。

中医学认为，急性心肌梗死属于胸痹心痛、真心痛等范畴。人体感受外邪和内邪积聚体内，日久化热化毒，形成瘀热壅毒、毒损心营、闭阻心脉引发心肌梗死。丹参通络解毒汤是在《温病条辨》清营汤和《时方歌括》丹参饮基础上，结合叶天士络病理论及临床实践化裁而来。方中丹参活血化瘀、清心止痛，玄参清营养阴、泻火解毒，二者共为君药，臣药有当归、川芎、红花、檀香行气活血、通络止痛。黄芩、黄连、栀子泻火解毒，又由于冠心病病程反复发作，邪踞日久，耗气伤正，方中佐以黄芪益气扶正，以增加益气活血功效。加水蛭增强活血通络作用，借其“蠕动之物可以松透病根”而直入络分搜剔血络，全方具有活血通络、清营解毒、益气养阴的功效，临床治疗冠心病取得一定的疗效[12]。范桄溥[13]采用抑制IκBα及NF- κB激活的心肌梗死模型小鼠，结果显示IL- 6、TNF- α的生成减少，梗死后炎症反应及心肌细胞损伤均减轻。李静等[14]发现，玄参提取物降低炎症细胞因子 TNF -α、IL- 6的浓度，抑制NF-kB的过量表达，从而对心肌具有明显保护作用。

综上所述，炎症反应在急性心肌梗死发生发展过程中具有重要影响。通过调节AMI后免疫炎症反应来减轻心肌组织缺血性损伤至关重要，而丹参通络解毒汤联合BMSCs移植，可以抑制AMI大鼠炎症反应，保护缺血心肌，其机制可能是通过调节NF- κB实现的。

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Effects of Danshen Tongluo Jiedu Decoction on NF-kappa B Mediated Inflammatory Response in Bone Marrow Stem Cell Transplantation Rats With Acute Myocardial Infarction

LI Xin- hui， LI Ya- jing， HUANG Miao- xin, XU Fu- li, XIAO Qing, GUO Chen- he

(Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208,China)

Objective: To explore the effect of Danshen Tongluo Jiedu Decoction on the inflammatory reaction mediated by NF- κB in acute myocardial infarction (AMI) rats by Bone marrow stem cell transplantation.Methods:The whole bone marrow adherent method was adopted for BMSCs separation and culture. The AMI model was established by closing the left anterior descending coronary artery of SD rats. SD rats were randomly divided into SH (sham group), AMI group (acute myocardial infarction group), BMSCs (BMSCs transplantation group), DSTLJD group (Danshen Tongluo Jiedu group), DSTLJD + BMSCs group (Danshen Tongluo Jiedu combined with BMSCs transplantation group), 10 in each group. BMSCs cell suspension injected directly into the edge of the myocardial tissue infarction area; Chinese medicine or physiological saline were administered by gavage.4 weeks later, by using enzyme- linked immunosorbent (ELISA) measure each group rats serum TNF -α、IL- 6 content was detected. Using immunohistochemical method to observe the myocardial NF- κB protein expression, and HE staining to observe the myocardial tissue pathological changes. Results: Compared with The AMI group, BMSCs, DSTLJD group, DSTLJD + BMSCs group rats serum level of TNF- α、IL- 6 and myocardial nuclear factor NF- κB protein expression were significantly reduced, the difference has statistically significant,the degree of myocardial injury was significantly improved; DSTLJD + BMSCs group was better than that of pure stem cell transplantation, and simple DSTLJD group, the difference has statistically significant.Conclusion: Bone marrow stem cell transplantation combined with Danshen Tongluo Jiedu Decoction can improve the myocardial injury, reduced the inflammatory reaction, and repair the ischemic myocardium in AMI rats. The mechanisms may be related to regulate the inflammatory reaction mediated by NF- κB.

Danshen Tongluo Jiedu Decoction; Acute myocardial infarction; NF- κB; IL- 6; TNF- α; Inflammatory reaction

湖南省教育厅科学研究重点项目(15A143);湖南省中医药科研计划项目(201559)；国家中医药管理局重点学科“中医各家学说”开放基金项目(2014GJXS02)

李鑫辉(1974-)，男，山西长治人，副教授，医学博士，硕士研究生导师，从事心血管疾病的临床与研究。

R285.5

B

1006- 3250(2017)07- 0931- 03

2016- 12- 15