三子养亲汤对哮喘小鼠EOT- 1、EOT- 3影响的实验研究❋

张博达，徐 升，李俊玲，董 滟

(1. 成都中医药大学，成都 610075； 2. 川北医学院附属医院，南充 637000； 3. 成都中医药大学附属医院，成都 610073)

【实验研究】

三子养亲汤对哮喘小鼠EOT- 1、EOT- 3影响的实验研究❋

张博达1,2，徐 升1，李俊玲1，董 滟3△

(1. 成都中医药大学，成都 610075； 2. 川北医学院附属医院，南充 637000； 3. 成都中医药大学附属医院，成都 610073)

目的：观察三子养亲汤对哮喘模型小鼠嗜酸性粒细胞活化趋化因子- 1(Eotaxin- 1，EOT- 1)、嗜酸性粒细胞活化趋化因子- 3(Eotaxin- 3，EOT- 3)的影响，探索三子养亲汤作用的分子机制。方法：按随机数字表法将小鼠分为三子养亲汤高、中、低剂量组及孟鲁司特组，模型组和空白对照组建立哮喘小鼠模型，测定其肺组织中EOT- 1、 EOT- 3蛋白与基因表达。结果：与模型组比较，孟鲁司特组、三子养亲汤高剂量组肺组织中EOT- 1、EOT- 3浓度明显降低，差异有统计学意义；三子养亲汤中剂量组肺组织中EOT- 1、EOT- 3浓度降低，差异有统计学意义。结论：三子养亲汤能改善哮喘小鼠症状，其机制可能与下调EOT- 1和EOT- 3的表达有关。

支气管哮喘；三子养亲汤；气道炎症；平滑肌细胞；嗜酸性粒细胞趋化因子

支气管哮喘是由多种细胞 (如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。前期实验研究证实，三子养亲汤能抑制哮喘炎症状态，而嗜酸性粒细胞在肺部组织的募集、活化趋化因子方面发挥了重要作用[1]。因此，本实验从EOT- 1、EOT- 3入手，探索三子养亲汤改善哮喘炎症状态的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择鼠龄4～8周的C57BL小鼠共65只，平均体质量(18～22)g。小鼠购于成都达硕动物实验有限公司(合格证号SCXK(川)2008- 24)，所有实验小鼠均喂饲于成都中医药大学动物实验中心。饲养条件要求：所有小鼠以标准的实验鼠饲料喂养，12 h持续灯光照射，室温维持在25 ℃左右，相对湿度维持于50%～70%。所有小鼠能自行进食、饮水，在上述条件适应性喂养1周后正式开始实验。

1.2 药品与试剂

“三子养亲汤”汤剂由莱菔子12 g、白芥子12 g、紫苏子12 g组成，试验药物购自四川中药材公司，由成都中医药大学药学院药剂科统一煎煮、浓缩；孟鲁司特片10 mg，杭州默沙东制药有限公司；OVA，sigma公司；Mouse Eotaxin1 ELISA kitIB- 22899试剂盒、 Mouse Eotaxin3 ELISA kitIB- 22897试剂盒、上海江莱生物科技有限公司；实时荧光定量PCR试剂盒，武汉博士德生物技术公司。

1.3 主要实验仪器

倒置生物显微镜CKX- 31，日本奥林巴斯公司；超临界萃取仪，SFT- 1000美国SFT公司；酶标仪，Multlskan Mk3赛默飞世尔仪器有限公司；小鼠肺功能仪 EMKA，France。

1.4 动物分组及造模

60只SPF级C57BL小鼠按随机数字表法分为空白组5只、孟鲁司特组5只、哮喘模型组20只和三子养亲汤高、中、低组各10只。哮喘小鼠模型采用腹腔注射卵蛋白加雾化激发复制，分别于第1天和第14天于腹腔内注射0．1%卵蛋白加氢氧化铝凝胶混合液(二者比例为1∶4，pH7.4)。15～28 d在自制玻璃箱中雾化吸入2%卵蛋白生理盐水5 ml，每日1次，每次持续30 min，连续激发14 d。空白组以相同方法雾化吸入0.9%生理盐水5 ml。

1.5 给药

灌胃和激发阶段同步进行。在每天激发前1 h，对中药组小鼠分别给予浓度10.8 g·kg-1·d-1、5.4 g·kg-1·d-1、2.7 g·kg-1·d-1的三子养亲汤中药汤剂1 ml灌胃。西药组小鼠用孟鲁司特0.004 g·kg-1·d-1药量1 ml进行灌胃，空白组使用生理盐水灌胃，连续灌胃2周。

1.6 小鼠肺功能测试

末次激发后进行小鼠无创肺功能测试，将小鼠置于EMKA肺功能雾化器中，按0 mg/ml、3.125 mg/ml、6.25 mg/ml、12.5 mg/ml、25 mg/ml、50 mg/ml由低到高雾化乙酰胆碱，并记录Penh值5 min。

1.7 肺组织中EOT- 1、 EOT- 3含量检测

用颈部脱臼法处死小鼠，剪开胸腔将实验小鼠左肺小心剥离，取5 g肺组织在无菌条件下匀浆，取匀浆细胞上清液。根据试剂盒测试要求处理受试样品，应用酶联免疫吸附法按试剂说明检测哮喘模型小鼠肺组织中EOT- 1、EOT- 3的含量。

1.8 形态学观察

小鼠处死后，肺组织标本以10%福尔马林固定，以苏木精- 伊红(H&E) 染色，并作病理切片，观察肺组织的形态变化。

1.9 EOT- 1、 EOT- 3 mRNA q- PCR 检测

小鼠肺组织用Trizol试剂提取总RNA，并检测其纯度及完整性制备cDNA。将引物离心，用去离子水稀释后与cDNA反应，经40个循环后所得结果用ΔΔCT法分析。

引物序列：从美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中搜索基因序列，使用Primer Premier 引物设计软件筛选各基因特异性引物。所有引物均交由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成，并以ULTRAPAGE纯化。

表1 本次检测所用引物及碱基序列

1．10 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠肺功能结果

表2显示，各组小鼠肺功能Penh值与乙酰胆碱浓度呈正相关，浓度低于12.5 mg/ml时，各组肺功能与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)；浓度高于12.5 mg/ml时，各组肺功能与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 小鼠肺功能结果

注：与空白组比较：#P<0.05

2.2 肺组织病理学观察

光镜下可见，空白组肺组织结构完整，模型组及各治疗组均可见不同程度的炎性细胞浸润、肺大疱形成、上皮水肿以及部分痰栓形成。正常组肺泡结构正常，肺组织形态无异常(见图A)；模型组支气管黏膜出现大量炎性细胞聚集、大量杯状细胞，肺泡腔扩大(见图B)；三子养亲汤高剂量组肺泡腔内偶见炎细胞散落，上皮水肿明显减轻，气管管壁无显著增厚(见图C)；三子养亲汤中剂量组内聚集少量炎细胞，气管管壁轻微增厚(见图D)；三子养亲汤低剂量组炎性浸润与上皮水肿轻微缓解，气管管壁有所增厚(见图E)；孟鲁司特组支气管腺体可见增生，少量杯状细胞聚集于气道内，少量黏液栓塞于小气道内(见图F)。

2.3 肺组织中EOT- 1、 EOT- 3蛋白与基因的含量测定结果

表3显示，与空白对照组比较，各组EOT- 1、EOT- 3蛋白与基因表达均增加(P<0.05)；与哮喘模型组比较，用药组中除三子养亲汤低剂量组外，哮喘模型小鼠肺组织中EOT- 1、EOT- 3蛋白与基因表达均降低(P<0.05)，提示三子养亲汤高中剂量及孟鲁司特能降低EOT- 1、EOT- 3蛋白与基因的表达；与孟鲁司特组比较，除三子养亲汤低剂量组外，哮喘模型小鼠肺组织中EOT- 1、EOT- 3含量比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示三子养亲汤中高剂量组对EOT- 1、EOT- 3的抑制与孟鲁司特组相当。

表3 三子养亲汤对哮喘小鼠EOT- 1、EOT- 3蛋白与基因的影响

注：与空白组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模组比较：#P<0.05，##P<0.01

图1 各组小鼠肺组织病理切片观察(HE×100)注： A.正常组；B.模型组； C.三子养亲汤高剂量组； D.三子养亲汤中剂量组；E.三子养亲汤低剂量组；F.孟鲁司特组

3 讨论

哮喘是与激活的肥大细胞密切相关的炎症反应性疾病。肥大细胞可被特异性抗原激活，通过IgE途径释放组胺及引起白三烯的合成，这些介质可以增加气道平滑肌张力引起气流阻塞。小鼠肺功能中乙酰胆碱浓度>12.5 mg/ml时，模型组Penh值对比空白组有统计学意义，支气管激发试验阳性，确定其为哮喘造模成功。

嗜酸性粒细胞是哮喘中重要的炎症细胞，EOT因其在体内外试验中发现对嗜酸性粒细胞有很强的选择趋化性而得名。研究发现，抗原诱导嗜酸性粒细胞在肺部组织的募集中eotaxin起主要作用。嗜酸性粒细胞被活化后可以分泌大量包含在嗜酸性颗粒内的活性物质，引起气道上皮细胞损伤，并导致气道高反应性(AHR)、慢性气道阻塞及气道炎症等临床症状。

EOT可分为3类，即EOT- 1、EOT- 2、EOT- 3，分别被称为CCL11、CCL24、CCL26[2]。Berkman等阐明，哮喘对象的气道受到变态反应激发后Eot- 3mRNA的表达不断增加，但未见Eot- 1，提示Eot- 3在迟发的哮喘反应中起重要作用。EOT除在嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和内皮细胞有明确的表达外[3]，还能在多种器官、组织和细胞中表达。多项研究发现，人支气管平滑肌细胞经过IL- 1β、IL- 9、IL- 13、IL- 4的刺激能表达Eot。其中IL- 9能诱导Eot- 1的表达，而IL- 4和IL- 13能诱导支气管平滑肌细胞表达Eot- 3，故支气管平滑肌细胞被认为是哮喘时导致嗜酸性粒细胞聚集Eot的重要来源细胞[4]。

三子养亲汤出自明·《韩氏医通》，具有降气消食、温化痰饮之功，为临床治疗哮喘的常用效方，方由紫苏子、白芥子、莱菔子3味药组成。苏子降气行痰、止咳平喘，白芥子温肺利气、快膈消痰，莱菔子消食导滞、行气祛痰，三者合用可使气顺痰消、食积得化、咳喘得平，用于咳嗽喘逆、痰多胸痞、食少难消、舌苔白腻、脉细滑等症[5]。“三子”均系行气消痰之品，以消为补，合而为用，可使气顺喘停、喘咳自愈。本研究通过比较各组病理改变发现，三子养亲汤具有减轻肺组织局部炎症水肿、减少黏液分泌作用。通过观察EOT- 1和EOT- 3、EOT- 1 mRNA、EOT- 3mRNA等指标发现，三子养亲汤能减少炎症因子释放，降低炎症反应发生，从而舒张支气管缓解哮喘症状，其机制可能是通过下调EOT- 1mRNA、EOT- 3 mRNA的表达，降低肺组织中EOT- 1和EOT- 3的含量而发挥作用。

[1] WENZEL SE，TRUDEAU JB，BARNES S，et al. TGF- R and IL- 13 synergistically increase EOT- 1 production in human airway fibroblasts[J]. The Journal of Immunology，2002，169(8)：4613- 4619.

[2] KITAURAM，SUZUKIN，IMAIT，et al. Molecular cloning of a novel human CC chemokine(EOT- 3)that is a functional lig- and ofCC chemodine receptor3[J].J BiolChem，1999， 274(39)：27975- 27980.

[3] BEIIANAN N，OHNONA S，CHUNG FK，et al. EOT- 3 but not eotaxin gene expression is upregulated in asdnnatics 24 hours after allergen challenge[J]. Am J Respir CellMol Biol， 2001，24：682- 687.

[4] ZUYDERDUYNS，HIEMSTRAPS，BABEKF，et al. TGF- beta differentially regulates TH2 cytokine- induced eotaxin and EOT- 3 release by human airway snooth muscle cells[J]. JAllergy C linImmunol， 2004，114(4)： 791- 798.

[5] 熊成熙，郑德明.试述三子养亲汤的构理与运用[J].安徽中医临床杂志，2003，15 (6)：537.

Experimental Study on the Effects of Sanzi Yangqin Decoction on EOT-1 and EOT-3 in Asthmatic Micee

ZHANG Bo- da1,2, XU Shen1, LI Jun- ling1, DONG Yan3△

(1. Chengdu University of TCM,Chengdu 610075, China; 2. North Sichuan Medical College,Nanchong 637000, China;3.Affiliated Hospital of Chengdu University of TCM,Chengdu 610073, China)

Objective：Research on the mechanism of Sanzi Yangqin Decoction controlling asthma. Method：Take sixty- five 4- 8 week old C57BL mice，randomly divided into the normal group and the experimental group. The mice model of chronic asthma was established through OVA sensitization. Then gavaged various doses of Sanzi Yangqin decoction or Montelukast. Deteating the EOT- 1 and EOT- 3 levels in the lung tissue homogenate. Results： Compared with the model group，the Eotaxin1 level in the cell supernatant of mice in the Montelukast group and SZ- H group is obviously reduced，Eotaxin3 level in the cell supernatant of mice in the SZ- L group is free from noted change，having no statistical significance. Conclusion： Sanzi Yangqin Decoction could reduce the EOT- 1and EOT- 3 levels in the lung tissue homogenate of mice with asthma.

Asthma; Sanzi yangqin decoction; Airway inflammation; Smooth muscle cells; Eotaxin

四川省科技厅科技攻关计划(2014SZ- 0071)-三子养亲汤通过抑制 CysLTs通路改善哮喘症状的机制研究

张博达(1982- )，男，四川南充人，讲师，医学博士，从事呼吸系统疾病的临床与基础研究。

△通讯作者：董 滟(1963- )，女，主任医师，博士研究生导师，从事中医内科学呼吸系统的临床与研究，E-mail:27517113@qq.com。

R285.5

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1006- 3250(2017)07- 0934- 03

2017- 01- 10