金番止泻胶囊对脾虚小鼠肠道菌群的影响及体外抗菌作用❋

刘佩沂，赖岳晓，田素英

(1. 中山市黄圃人民医院，广东 中山 528429； 2. ．广东药科大学，广州 510006； 3.广东省化妆品工程技术研究中心，广州 510006)

【实验研究】

金番止泻胶囊对脾虚小鼠肠道菌群的影响及体外抗菌作用❋

刘佩沂1，赖岳晓1，田素英2,3△

(1. 中山市黄圃人民医院，广东 中山 528429； 2. ．广东药科大学，广州 510006； 3.广东省化妆品工程技术研究中心，广州 510006)

目的: 探讨金番止泻胶囊对脾虚小鼠肠道菌群的调节作用及体外抗菌作用。方法: 利用番泻叶灌胃加饥饱失常复制小鼠脾虚模型，经金番止泻胶囊治疗后，以菌落计数法检测其盲肠内容物中双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌及肠杆菌的数量；采用纸片扩散法、试管2倍稀释法考察金番止泻胶囊对枯草杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌的抑菌作用。结果： 与正常组比较，模型组双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌及肠杆菌数量均升高，金番止泻胶囊高(1.2 g·kg-1)、低剂量组(0.6 g·kg-1)指标均有一定的恢复并接近正常水平。对枯草杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌的MIC(mg·mL-1)分别为12.8、8.51、6.4、7.6、8.27。结论: 金番止泻胶囊对脾虚小鼠肠道菌群有调节作用，在体外有抑菌作用。

金番止泻胶囊；脾虚；肠道菌群；体外抗菌

金番止泻胶囊选用我国资源丰富的番石榴叶、金樱根等为原料，金樱根[1-2]、番石榴叶[3]有很好的抗菌调节菌群的作用。金番止泻胶囊是分别用水、乙醇提取各药有效部位，按前期实验的最佳比例制成。方中药味数较少，制备工艺简单，原料成本较低，药效显著。

1 材料

KM小鼠由广东药科大学实验动物中心提供(动物许可证号SCXK (粤) 2012- 0125)，饲养于温度(20±2)℃、湿度(60%±10%)的环境下。伊红美蓝培养基(EMB)、肠球菌培养基(EC)、双歧杆菌培养基(改良MRS)、乳酸杆菌培养基(MC) 由实验室自制。自制金番止泻胶囊，番泻叶(购于广东康圣药业，批号20150710)按常规方法煎成生药浓度为1 g·mL-1的水煎液。丽珠肠乐(丽珠集团丽珠制药厂，0.5亿活菌/20粒，批号 20150715)、黄连小檗碱片(青岛黄海制药有限责任公司，国药准字H37021111)。

2 方法

2.1 对脾虚小鼠肠道菌群的调节作用

表1显示， 健康小鼠60只雌雄各半。除正常组外，其余50只小鼠ig番泻叶水煎液(15 mg·g-1)，并隔天禁食。连续造模8 d后，小鼠出现成群蜷缩、拱背，摄食减少，粪便松软膨大、不成形甚至便溏，部分出现脱肛、毛色晦暗、体质量下降等脾虚症状，提示造模成功。挑选造模成功的小鼠将其分为模型组、金番止泻胶囊低剂量组(0.6 g·kg-1)、高剂量组(1.2 g·kg-1)、丽珠肠乐阳性组(0.3 g·kg-1)，正常组及模型组给予等量蒸馏水，连续10 d，观察并记录小鼠状况。无菌状态下取盲肠内容物0.1 g置于EP管中，加入0.9 mL无菌生理盐水，经震荡器均质所得标本液按稀释度为10-1，依此操作稀释标本至10-6，采用涂布法定量接种0.1 mL细菌混悬液，肠杆菌、肠球菌需氧培养24 h，双歧杆菌、乳酸杆菌厌氧培养48 h。根据各菌落在培养基上的菌落特征及革兰染色进行初步鉴定，结果以菌落形成单位/g(CFU·g-1) 的对数表示。

表1 小鼠粪便中肠道菌群检测结果

注：与模型组比较:*P<0.05;与正常对照组比较:#P<0.05。

3 结果

3.1 金番止泻胶囊对脾虚小鼠肠道菌群的调节作用

表1显示，给予脾虚模型小鼠金番止泻胶囊后实验所选4种主要肠道菌群基本恢复到正常水平。与正常组比较，各肠道菌群数量增加差异无统计学意义。与模型组组比较，各肠道菌群的数量差异有统计学意义(P<0.05)，说明金番止泻胶囊具有扶植正常菌群生长和调整菌群失调的作用；且金番止泻胶囊高剂量组与阳性组差异无统计学意义，而低剂量组肠道菌群的恢复效果低于阳性组。

3.2 体外抗菌作用

表2显示，取灭菌后番金止泻胶囊10 g用无菌生理盐水溶化备用(含药量为6.7 g.100 mL-1)。将菌种接种到100 mL营养肉汤培养基中，摇床37 ℃扩菌24 h。吸取菌悬液0.5 mL于无菌试管中，加4.5 mL无菌生理盐水定容10倍稀释。精密移取灭菌过的15 mL营养琼脂于试管中，用1 mL无菌滴管分别移取0.2 mL 10-5～10-9各浓度的菌悬液于试管中，摇匀后倒入培养皿中，于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，无菌纸片含各药物500 μg。测量抑菌圈的直径大小。

试管2倍稀释法：各取2 mLMH肉汤分别加入10支无菌试管中。1号管加入药液2 mL混合均匀后吸移取2 mL加入2号管,依法稀释至8号管，吸取2 mL弃去，10号管为肉汤无菌生长对照管，9号管为细菌生长对照管。除10号管，用无菌加样器在其余各管中加入菌液100 μL，置于37 ℃恒温箱内培养16 h。凡澄清透明的管定为无菌生长，以无菌生长的最高药物稀释度为该药液对细菌的MIC。

表2 金番止泻胶囊体外抗菌实验结果

3.3 金番止泻胶囊的体外抗菌作用

表2显示，番金止泻胶囊痢疾杆菌、金葡球菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌均有抑菌活性作用。

试管2倍稀释法结果显示，番金止泻胶囊对痢疾杆菌、金葡球菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌的MIC(mg·mL-1)依次为8.27、6.40、7.60、8.51、12.80。

4 讨论

小鼠脾虚模型的制备方法较多，如过度抗生素法[5]番泻叶泻下致脾虚模型是大家公认的方法[6]但考虑饮食失节疲倦过度也可致脾虚，故本实验采用番泻叶泻下加隔天禁食法制备小鼠脾虚模型。本实验中，脾虚小鼠肠道双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌和肠杆菌数量有所减少，可能是因为腹泻严重导致肠道内常驻菌大量排出，以致肠道内微生态失调，经金番止泻胶囊治疗后，菌落数趋于恢复正常，且高剂量(1.2 g·kg-1) 作用更好，有量效关系。

金番止泻胶囊对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌等所选细菌在体外均有明显的抑菌作用，抑菌圈边缘清晰，与黄连小檗碱进行对照，但效果不及黄连小檗碱。

[1] 谭年秀，郭巧玲，田素英．金樱根的药用历史及现代研究概况[J]．亚太传统医药，2010,6(12)：167- 169．

[2] 赖岳晓,严寒静,田素英,等.金樱根提取物体外抑菌活性的实验研究[J].今日药学，2012,22(9):531- 433．

[3] 王芳,王力,董乐,等．番石榴叶提取物的鉴定及其抗菌作用[J].分子科学学报，2007，3(5):365- 367．

[4] 高云芳,姚洋.不同剂量四君子汤对脾虚证小鼠消化和免疫功能的影响[J].中草药,2007,38(4):558- 562．

[5] 王艳,张立,田素英,等.金樱根、金樱茎多糖对肠道菌群失调小鼠调整作用的研究[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(20):270- 272.

[6] 陈学习.脾虚证动物模型复制方法研究概况评价与思考[J].中国当代医药,2010,17(33):5- 6.

Effect of Jinfan Zhixie Capsule on Gut Flora in Spleen- deficiency Mice and in Vitro Bacteriostasis

LIU Pei- yi1, LAI Yue- xiao1, TIAN Su- ying2,3△

(1. Zhongshan Huangpu People's Hospital,Zhongshan Guangdong 5284292,China; 2. Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou Guangdong 510006,China; 3. Guangdong Cosmetics Engineering & Technology Research Center,Guangzhou 510006,China)

Objective: To observe the effects of gut flora in spleen- deficiency mice and in vitro bacteriostasis of Jinfan Zhixie Capsule(JZC).Methods: Establishing the spleen- deficiency mice model with senna extract and fully and poorly feeding food in turn,and then detect the number of Bifidobacterium,Lactobacillus,Enterococcus and Escherichia coli in mice cecum contents by colo- ny counting after treated with JZC.By filtering paper method and tube double dilution method to inspec the bacteriostasis effect for Bacillus subtilis,Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Shigella,Salmonellatyphi on JZC. Results: Compared with the normal control group，the number of Bifidobacterium,Lactobacillus,Enterococcus,and Escherichia coli in mice cecum contents increased in model group.After treated with the 1.2 g·kg-1and 0.6 g·kg-1of JZC，all the indexes have certain recovery and close to the normal level. The MIC values(mg·mL-1)againsts Bacillus subtilis,Escherichiacoli,Staphylococcus aureus,Shigella,Salmonellatyphi respectively were 12.8、8.51、6.4、7.6、8.27.Conclusion JZC has dependent manner recovered the gut flora in spleen- deficiency mice,and in vitro bacteriostasis.

Jinfan Zhixie capsule; Spleen deficiency; Gut flora; in vitro bacteriostasis

广东省中医药局建设中医药强省课题项目 (20151126); 2014 年广东省大学生创新创业训练计划项目(2014036);广东药科大学“创新强校工程”医药化工省级实验教学示范中心资助项目

刘佩沂(1976-)，女，主任药师，从事中药学的临床与研究。

△通讯作者：田素英，从事中药应用教学与研究，Tel：15362965291,E-mail:zsxqtsy@126.com。

R285.5

B

1006- 3250(2017)07- 0937- 02

2017-03-16