Dermol与N-cadherin在喉鳞状细胞癌组织中的表达及相关性研究

杨文婧　赵瑞力



·基础研究·

Dermol与N-cadherin在喉鳞状细胞癌组织中的表达及相关性研究

杨文婧赵瑞力＊

【摘要】目的探讨喉鳞状细胞癌(LSCC)组织中Dermol与N-cadherin的表达及意义。方法应用免疫组织化学S-P法检测Dermol与N-cadherin在48例LSCC组织及30例癌旁正常组织中的表达情况，分析它们在不同组织中的相互关系及与LSCC临床参数的关系。结果Dermol、N-cadherin在LSCC中的阳性表达率分别为58.33%和75.00%，高于喉正常黏膜的16.67%和40.00% (P<0.05)；Dermol、N-cadherin在LSCC中的阳性表达与淋巴结转移(N+组高于N0组，P<0.05)、临床分期(Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期，P<0.05)相关；而与肿瘤病理学分级、临床分型及年龄分组无关(P>0.05)。LSCC中Dermol的阳性表达与N-cadherin的阳性表达呈正相关(r=0.390，P=0.016)。结论Dermol与N-cadherin在LSCC发生、侵袭及转移过程中起重要作用，Dermol与N-cadherin的协同作用可能影响LSCC的转移。(中国眼耳鼻喉科杂志，2016，16：88-91)

【关键词】喉鳞状细胞癌；Dermol；N-cadherin；免疫组织化学

喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)在喉癌中最为多见，具有较高的侵袭性，发生局部复发和转移的能力较强[1]。碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)家族因子参与了上皮间质转化及抑制细胞凋亡的发生，与恶性肿瘤的侵袭和转移有着密切关系。Dermol(也称为Twist2)属于bHLH蛋白家族成员。国外有研究[2]发现，Dermol蛋白在头颈部肿瘤中表达上调，并与N-cadherin协同作用诱导上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的发生。Dermol在LSCC中的表达研究尚属空白。本研究采用免疫组织化学方法检测LSCC组织中Dermol和N-cadherin的表达，探讨两者的表达与LSCC发生、侵袭及转移的关系。

1资料与方法

1.1资料收集LSCC组织48例及癌旁安全切缘1 cm以上正常组织30例，来自于本院耳鼻喉科2010年2月～2013年3月LSCC手术切除的标本和手术切除的癌旁正常组织(均经病理检查证实)。本研究已经医院伦理委员会通过。所有LSCC患者术前都未行放、化疗，临床资料完整。LSCC病例中，高分化13例、中分化19例、低分化16例；Ⅰ、Ⅱ期(早期)18例，Ⅲ、Ⅳ期(晚期)30例；声门上型17例、声门型31例。年龄41～80岁，中位年龄60.2岁。喉癌患者中有淋巴结转移者24例、无淋巴结转移者24例。

1.2方法

1.2.1主要试剂Dermol鼠单克隆抗体(Twist2C1a)(sc-81417, Santa Cruz Biotechnology Inc)；N-cadherin鼠单克隆抗体(ZM-0094,北京中衫金桥生物技术有限公司)；鼠二抗免疫组织化学试剂盒(SP-9002，北京中衫金桥生物技术有限公司)；二氨基联苯胺(DAB)显色液 (ZLI-9032，北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2.2免疫组织化学S-P方法所选标本均制成石蜡标本，4 μm连续切片。一抗所选浓度：Dermol鼠单克隆抗体为1∶100，N-cadherin鼠抗人单克隆抗体为1∶50。采用免疫组织化学S-P法，严格遵守操作步骤进行实验。设置磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗为阴性对照，为质量控制标准；癌旁正常组织为正常对照组。

1.3结果判定标准Dermol、N-cadherin蛋白阳性着色位于细胞质，出现片状或颗粒状的胞质或胞核呈棕褐色的细胞为阳性细胞。结果采用半定量记分法判定[3]，按阳性着色程度评分：0分为无着色；1分为浅黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色。再按阳性细胞所占比例评分：0分为阴性；1分为<10%；2分为11%～50%；3分为51%～75%；4分为>75%。用两者的乘积来判定结果：4～12分定为阳性，4分以下定为阴性。

1.4统计学处理得出数据经Excel整理，并应用SPSS19.0统计软件进行统计分析。结果采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1Dermol和N-cadherin在LSCC及癌旁组织中的表达Dermol蛋白表达位于细胞质中，呈棕褐色。Dermol在LSCC组织中呈高表达，在癌旁组织中呈低表达或不表达。免疫组织化学检测：48例LSCC组织中Dermol的阳性表达率为58.33%(28/48)，30例癌旁正常组织的阳性表达率为16.67%(5/30)，前者明显高于后者，差异有统计学意义(χ2=13.131，P<0.01)(图1～2，表1)。

N-cadherin阳性着色呈浅黄至棕黄色，小片状或弥漫性分布于细胞质中。N-cadherin的高表达出现在LSCC组织中，中、低表达或不表达出现于癌旁正常组织中。免疫组织化学检测：48例LSCC组织中N-cadherin的阳性表达率为75.00%(36/48)，30例癌旁正常组织的阳性表达率为40.00%(12/30)。LSCC组织高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义(χ2=9.555，P<0.01)(图3～4、表1)。

图1.　Dermol在正常组织中呈阴性表达(IHC 400×)

图2.　Dermol在LSCC组织中呈阳性表达(IHC 400×)

图3.　N-cadherin在正常组织中呈阴性表达(IHC 400×)

图4.　N-cadherin在LSCC组织中呈阳性表达 (IHC 400×)

组别nDermol+-P值N-cadherin+-P值正常组织30525LSCC组织4828200.000121836120.000

2.2LSCC中Dermol、N-cadherin的表达及与LSCC临床病理参数的关系

1)在LSCC组织中，Dermol在伴有淋巴结转移组的阳性表达率高于无淋巴结转移组，两者差异有统计学意义 (P<0.05)；N-cadherin在伴有淋巴结转移组的阳性表达率高于无淋巴结转移组，两者差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

2)根据TMN分期，Dermol在Ⅰ、Ⅱ期(早期)病例组的阳性表达率低于Ⅲ、Ⅳ期(晚期)病例组，两者差异有统计学意义(P<0.05) ；N-cadherin在Ⅰ、Ⅱ期(早期)病例组的阳性表达率低于Ⅲ、Ⅳ期(晚期)病例组，两者差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2　Dermol和N-cadherin与LSCC临床参数的相关性

3)Dermol和N-cadherin在高分化LSCC中的阳性表达率与在中、低分化LSCC中的阳性表达率差异均无统计学意义(表2)。

4)Dermol与N-cadherin在声门上型LSCC的阳性表达率与在声门型LSCC的阳性表达率差异无统计学意义(P值均>0.05)(表2)。

5)以60周岁为分界线，Dermol与N-cadherin在年龄分组中比较，差异无统计学意义(P值均>0.05)(表2)。2.3Dermol和N-cadherin在LSCC中的相关性经Spearman等级相关分析，两者表达呈正相关(r=0.390，P=0.016) (表3)。

表3　LSCC组织中Dermol和N-cadherin表达的相关性

3讨论

EMT在恶性肿瘤的侵袭、转移过程中起重要作用，是肿瘤发展过程中的关键程序之一。Twist1、Dermol同属于bHLH转录因子家族,在不同的种属之间其核苷酸和氨基酸序列高度保守。Dermol是在使用E12作为引物的一种双酵母杂交体中首次被发现的，由于它的表达模式是在老鼠胚胎的真皮组织中，所以称为Dermol[4]。后来由于Dermol与Twist1的高度同源和表达模式的重叠性被命名为Twist2。目前有研究[5]表明，Twist1可以诱导EMT的发生。Dermol与Twist1高度同源，可能具有与Twist1相似的诱导EMT发生的作用。Dermol在乳腺癌、结肠癌、胃癌、甲状腺癌及肝癌中表达上调在国内外已有相关报道[6-13]。目前在对头颈部LSCC患者的研究中发现，Dermol通过EMT、抑制细胞凋亡有助于头颈部LSCC的侵袭[2]。但其在LSCC中的表达研究罕见报道。本研究结果显示： Dermol在LSCC组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，且其表达在淋巴结转移(N+组高于N0组)、临床分期(Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期)中差异具有统计学意义，而与肿瘤病理学分级、临床分型及年龄分组无关(P>0.05)。由此可推断，Dermol高表达的LSCC组织具有更强的侵袭能力。Dermol可能成为判断LSCC预防或预后的检测指标之一。

N-cadherin表达异常是EMT过程中的重要分子事件。在上皮组织中，N-cadherin的异位表达影响了上皮细胞的行为及形态，诱导上皮组织向间质转化，即产生EMT。目前的研究发现，N-cadherin在脑胶质母细胞瘤[14]、前列腺癌[15]及乳腺癌[16]中表达上调，协同E-cadherin表达下调在肿瘤的侵袭及转移方面起重要作用。本研究发现，LSCC中N-cadherin阳性表达明显高于癌旁正常组织；LSCC的转移、侵袭能力越高，N-cadherin的阳性表达率越高，也同样证实了N-cadherin与LSCC的侵袭和转移相关，此研究结果与国内外研究结果一致。

综上所述，通过对EMT机制研究发现，Dermol形成Twist1/Twist2/Mi2/NuRD蛋白复合物，其与E-box的启动子结合，下调E-cadherin的表达，导致了EMT的发生。在E-cadherin表达减少的区域，N-cadherin 的表达明显增多。由此一些学者[17-18]认为，可能存在E-cadherin向N-cadherin转化，从而使细胞由良性转化为浸润性的恶性表型。这同样可能是LSCC侵袭和转移的途径之一。本研究结果同时显示：Dermol的阳性表达率越高，N-cadherin的阳性表达率越高，LSCC的侵袭、转移能力越强，Dermol蛋白表达与N-cadherin的表达之间存在明显正相关(r=0.390,P=0.016)。由此可推测：Dermol、N-cadherin的过度表达可能协同促进了EMT的发生，导致了LSCC的发生和侵袭。同时检测LSCC中Dermol和N-cadherin的表达可能有助于对肿瘤进展风险性的分级。Dermol在LSCC中的调控机制及与患者预后和生存率的关系有待进一步研究。

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(本文编辑杨美琴)

Expression of Dermol and N-cadherin in laryngeal squamous cell carcinoma and their correlation

YANGWen-jing,ZHAORui-li＊.

DepartmentofOtorhinolaryngology,CangzhouPeople’sHospitalofHebeiProvince,Cangzhou061600,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of Dermol and N-cadherin in laryngeal squamous cell carcinoma(LSCC). MethodsThe expression of Dermol and N-cadherin was detected by immunohistochemistry S-P method in 48 LSCC tissues and 30 tumor-adjacent normal tissues . The relationship between two factors and the clinical pathological features of LSCC were investigated. ResultsThe positive expression rates of Dermol and N-cadherin in LSCC tissues were 58.33% and 75.00%,and were 16.67% and 40.00% in the adjacent tissues (P<0.05). Expressions of Dermol and N-cadherin in LSCC tissues were correlated with lymph node metastasis(the expressions in N+ were higher than those in N0, P<0.05),clinical stage(the expressions in phrase Ⅲ and Ⅳ were higher than those in phrase Ⅰ and Ⅱ,P<0.05),but weren’t correlated with pathological grading of the tumor, patients clinical classification and age (P>0.05). The positive expression of Dermol was related to that of N-cadherin( r=0.390, P=0.016). ConclusionsDermol and N-cadherin play an important role in the pathogenesis, infiltration and metastasis of LSCC. The synergism of Dermol and N-cadherin may have some effects on the infiltration and metastasis of LSCC. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:88-91)

【Key words】Laryngeal squamous cell carcinoma; Dermol; N-cadherin；Immunohistochemistry

(收稿日期2015-05-24)

DOI:10.14166/j.issn.1671-2420.2016.02.006

通讯作者：杨文婧(Email: 15075733387@139.com)

Corresponding author：YANG Wen-jing, Email: 15075733387@139.com

作者单位：河北省沧州市人民医院耳鼻喉科沧州061600；＊河北医科大学第四医院耳鼻喉科石家庄050000