姜黄素对AD大鼠学习记忆能力的改善及其与大脑皮质NF-κB和Bcl-2Bax表达的关系

张春燕+赵志英+张向荣+田恒文+崔俊梅+阿拉腾+吴腾

[摘要] 目的 观察姜黄素对阿尔茨海默病（AD）大鼠学习记忆能力的改善，以了解其对AD大鼠学习记忆能力的影响与大脑皮质内NF-κB及Bcl-2和Bax表达的关系，从而探讨姜黄素治疗AD的可能机制。 方法 将90只大鼠随机分为6组，AD模型组、AD模型＋姜黄素低剂量组、AD模型＋姜黄素中剂量组、AD模型＋姜黄素高剂量组、假手术组和正常对照组，每组各15只。各组大鼠均通过Morris水迷宫观察其学习记忆能力的改变；采用免疫组织化学方法结合图像分析观察各组大鼠大脑皮质的NF-κB免疫反应性细胞的表达变化，采用Western blot方法检测各组大鼠大脑皮质Bcl-2和Bax蛋白的表达。 结果 姜黄素可有效改善AD大鼠的学习记忆能力，并呈剂效关系，大剂量的效果更好。姜黄素可以缩短AD模型大鼠水迷宫测试的潜伏期（P<0.05），姜黄素低、中、高剂量治疗组大鼠寻找目标象限所需时间缩短；免疫组织化学结果显示：模型组NF-κB蛋白表达较对照组降低（P<0.01）；姜黄素各剂量组NF-κB蛋白表达较模型组增高（P<0.05），且姜黄素高剂量组高于姜黄素低剂量组（P<0.05）。Western blot结果显示：Bcl-2蛋白与NF-κB在各组大鼠大脑皮质中的表达趋于一致；模型组Bcl-2蛋白表达与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）；姜黄素各剂量[30、60、100 mg/（kg·d）]组Bcl-2蛋白表达较模型组分别增加14.56%、22.12%和32.87%（P<0.05）。AD模型组大鼠大脑皮质Bax蛋白表达与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）；姜黄素不同剂量[30、60、100 mg/（kg·d）]组Bax蛋白表达与AD模型比较，分别减少26.37%、37.56%和47.32%（P<0.05）。 结论 姜黄素可效改善AD大鼠的学习记忆能力，且随着剂量的增加治疗效果改善更加明显；姜黄素促进Bcl-2的上调及Bax的减少可能是姜黄素改善AD大鼠学习记忆能力的机制之一；姜黄素可通过激活大脑皮质NF-κB途径调控凋亡调节基因的表达而发挥对AD的治疗作用。

[关键词] 姜黄素；阿尔茨海默病；核转录因子-κB；凋亡调控因子；免疫组织化学；Morris水迷宫

[中图分类号] R965.1[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）04（c）-0004-05

Relationship between amelioration of curcumin on learning and memory ability and the contents of NF-κB and Bcl-2,Bax in cortex of AD rats

ZHANG Chun-yan1 ZHAO Zhi-ying2▲ ZHAN Xiang-rong3 TIAN Heng-wen1 CUI Jun-mei1 ALA Teng1 WU Teng1

1.The Fourth Affiliated Hospital of Baotou Medical College,Inner Mongolia University of Science and Technology;The Eighth Hospital of Baotou City,Baotou 014010,China;2.Baotou Medical College of Inner Mongolia University of Science and Technology,Baotou 014010,China;3.Baogang No.3 Hospital,Baotou 014010,China

[Abstract] Objective To observe the amelioration and mechanism of curcumin on the learning and memory ability of AD rats,in order to understand the impact of AD rats learning and memory abilities and brain cortex NF-κB,Bax and Bcl-2 expression and the relationship between so as to explore the possible mechanism of curcumin to treat AD. Methods 90 SD rats were divided randomly into the control group,imitated operating group,AD model group,AD model plus curcumin low level group,AD model plus curcumin low middle group,AD model plus curcumin high level group,each group of 15 rats.Groups of rats were observed by Morris water maze changes in its learning and memory ability.The immunohistochemical method and combining with image were Used to analysis to observe each rat cerebral cortex of the NF-κB changes the expression of cell immune response,the Western blot method was used to detect the Bcl-2 each rat brain cortex and the expression of Bax protein.Results Curcumin had ability of therapy on AD,curcumin could ameliorate the learning and memory ability of AD rats,and showed dose dependence.Curcumin could shorten the incubation period of experimental rats testing in water maze.Immunohistochemical results showed:the expression of NF-κB was degraded in the cortex of AD model rats compare with the control group (P<0.01).Curcumin could raise the expression of NF-κB in the cortex of AD model rats (P<0.05),and AD model plus curcumin high group was higher than low level group (P<0.05).The Bcl-2 protein and the NF-κB in each group to have consistent expression in cortex of rats,the Bcl-2 protein in the model group expression differences compared with normal control group was statistically significant (P<0.01).Curcumin each dose [30,60,100 mg/(kg·d)] group the Bcl-2 protein expression increased by 14.56%,22.12% and 32.87% respectively than model group (P<0.05).Bax protein expression in the rat brain cortex AD model group compared with normal control group,the difference was statistically significant (P<0.01).Curcumin each dose [30,60,100 mg/(kg·d)] group Bax protein expression and AD model was reduced by 26.37%,37.56% and 47.32% respectively (P<0.05). Conclusion Curcumin has the therapeutic action to AD,and improve the learning and memory ability of AD rats.The therapeutic action ameliorated of curcumin to Alzheimer disease are related with decreased the expression of Bax and increased expression of Bcl-2.Curcumin has therapeutical effect on AD through regulating the expression of NF-κB and apoptosis related genes.

[Key words] Curcumin;Alzheimer disease;NF-κB;apoptosis related genes;Immunohistochemistry;Morris water maze

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是老年期常见的疾病之一，其临床表现为进行性记忆障碍，是一种中枢神经系统退行性疾病，目前研究认为，各种原因引起的神经细胞氧化应激损伤、细胞凋亡、脑组织神经营养因子含量降低等是AD的主要发病原因。大量研究资料证实，神经细胞凋亡是AD神经元丢失的主要原因[1]，细胞凋亡在AD发病机制中的作用是目前AD研究的一大热点。

核因子-κB（NF-κB）广泛存在于真核细胞中，是一类促进基因转录的蛋白质的总称。其对于AD的发生、发展有重要影响，近年来得到广泛关注[2-3]。NF-κB通过凋亡相关基因的表达发挥抗神经细胞损伤作用，Bcl-2和Bax是参与该作用的凋亡调控基因，Bax是促进凋亡，Bcl-2则抑制凋亡。其蛋白产物可以形成异二聚体或同二聚体，发挥不同的作用，两者的含量之比决定最终的结果[4-5]。

姜黄素具有抗痴呆、抗氧化、降血脂等作用[6]，可减轻神经细胞损伤[7]，其主要作用机制可能是下调APP和早老素-1表达，减少AD大鼠脑组织中Aβ的异常聚集。姜黄素抑制淀粉样蛋白25～35（Aβ25～35）和1-甲基-4苯基吡啶离子（MPP+）诱导PC12细胞凋亡[8-9]。姜黄素具有多种抗炎作用，从而可以对AD等疾病进行治疗[10-11]。

本实验通过观察姜黄素对AD大鼠学习记忆能力的改善及其对AD大鼠学习记忆能力的影响与大脑皮质内NF-κB及Bcl-2和Bax的关联，以探讨姜黄素治疗AD的机制，为姜黄素用于AD临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

清洁级健康雄性Wistar大鼠90只，体重200～250 g，购自内蒙古大学实验动物中心，许可证号：SCXK（蒙）2002-0001。

1.1.2 主要试剂

兔抗大鼠NF-κB多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗体（美国R＆D公司），兔抗大鼠Bax多克隆抗体（美国R＆D公司）。

1.1.3 药物

姜黄素购于瑞士Fluka公司（纯度为99.9%）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组

将90只Wistar大鼠随机分为正常对照组、假手术组（以等量生理盐水代替Aβ25～35）、AD模型组、AD模型＋姜黄素低剂量组[腹腔给予40 mg/（kg·d）姜黄素，术后第2天开始，共治疗4周]、AD模型＋姜黄素中剂量组[腹腔给予60 mg/（kg·d）姜黄素]、AD模型＋姜黄素高剂量组[腹腔给予100 mg/（kg·d）姜黄素]，共6组，每组15只；正常对照组和假手术组腹腔注射与姜黄素等体积生理盐水。

1.2.2 学习记忆能力的检测及分析

Morris水迷宫为1个直径150 cm、高60 cm的圆形水池，内壁漆为黑色。池内水深42 cm，水温（22±1）℃。房间内光照恒定，无光线反射在水池内。将水池分为东北（EN）、东南（ES）、西北（WN）、西南（WS）4个象限，在EN象限中央距池壁35 cm处放置1个直径8 cm、高40 cm的圆形透明站台，站台低于水面2 cm。迷宫上方安置与显示系统连接的摄像机，受试动物测试结果采用北京硕林苑科技有限公司开发的动物行为实验专用软件处理。药物治疗2周后，用Morris水迷宫对大鼠进行行为学检测。

1.2.2.1 定位航行试验实验前1 d，让大鼠熟悉水迷宫环境。第2天开始正式实验，实验历时5 d，每天分上、下午2个时间段，每段时间训练4次，分别从ES、EN、WS、WN 4个点入水，试验时，选择任一象限，将大鼠面部背向站台沿池壁放入水中，计算寻找站台的时间，如规定时间内未找到平台，则由实验者将其引向平台，其潜伏期记为120 s。

1.2.2.2 空间探索试验将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠在2 min内的游泳轨迹，计算大鼠在原平台象限的游泳距离占总游泳距离的百分比，以此判断大鼠的记忆能力。

1.2.3 大鼠脑组织Bax和Bcl-2蛋白含量的测定

大鼠按400 mg/kg剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠。断头处死，快速取出全脑，用凝胶图像处理系统分析目标条带与内参照条带净吸光度的比值。

1.2.4 NF-κB免疫组织化学染色

1.2.4.1 组织制备动物麻醉成功后，各组随机取5只大鼠大脑，作恒冷箱冷冻切片，行NF-κB免疫组织化学染色。大鼠脑用振荡切片机冠状位连续切片，厚约30 μm。切片经室温风干或电吹风（冷风）吹干后即可开始作染色处理。

1.2.4.2 SABC法免疫组织化学染色①裱片阴干或冷风吹干，经PBS洗5次，每次10 min；②3%（H2O）6 SABC复合物，37℃孵育30 min，PBS洗2次，每次10 min，TBS洗1次，10 min；③DAB显色1～5 min，注意避光，镜下观察染色，尽可能使背景染色一致，PBS洗5次，每次10 min，蒸馏水洗3次，每次5 min；④常规脱水，透明，树胶封片；⑤阴性对照以PBS代替一抗，其他步骤不变。

1.2.4.3 NF-κB在脑组织表达的观察和图像分析用Olympus显微镜（CX-41）及形态图像分析系统进行观察。选取3只大鼠的NF-κB免疫组织化学染色切片，每只动物取相同位置5张脑片，在高倍物镜下拍摄照片并观测，计数NF-κB阳性神经元的数目和积分光密度。

1.3 统计学处理

所得数据均采用SPSS 12.0统计软件进行处理，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，采用重复测量的单因素方差分析（Post－way RANOVA）比较各组大鼠寻找站台的逃避潜伏期的差异，采用Tukey法两两比较组间差异，平台象限游泳距离占总游泳距离的百分比采用One-way ANOVA单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 学习记忆能力的检测结果

2.1.1 不同组大鼠逃避潜伏期的结果

模型组寻找平台的时间最长，平均逃避潜伏期为（78.36±17.45）s，与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01）；姜黄素低剂量组的寻找平台时间与中剂量组、高剂量组相比，差异有统计学意义（P<0.05），而高剂量组寻找平台的时间与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

表1 各组大鼠寻找平台平均潜伏期的比较（s，x±s）

与其他组比较，*P<0.01；与正常组比较，#P>0.05；与正常组、假手术组及高剂量组比较，△P<0.05

2.1.2 各组大鼠平台象限游泳距离百分比的比较

模型组大鼠在平台象限的游泳占总游泳时间的百分比为22.4%，正常组为45.3%，差异有统计学意义（P<0.01）；姜黄素高剂量给药组为40.8%，中剂量组为31.3%，主要集中在平台象限，两组差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 姜黄素对AD模型大鼠大脑皮质NF-κB表达的影响

各组大鼠神经元及胶质细胞均可见NF-κB免疫组织化学染色阳性细胞。正常组大鼠大脑皮质有较多NF-κB免疫组织化学染色阳性细胞，在胞质、胞核中均有表达，呈浅棕黄色，弥漫或颗粒状分布（图1）。AD模型组大鼠脑皮质（图2）较对照组NF-κB免疫组织化学染色阳性细胞数量减少，染色变浅；姜黄素各给药组与模型组相比，NF-κB免疫阳性细胞数量增加，染色加深（P<0.05）。模型组NF-κB阳性细胞计数和平均积分光密度比正常对照组降低（P<0.01）；而姜黄素各给药组NF-κB阳性细胞计数和平均积分光密度显著升高（P<0.05），且呈剂量依赖性，姜黄素低剂量组NF-κB阳性细胞计数和平均积分光密度低于姜黄素高剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）；姜黄素高剂量组NF-κB阳性细胞计数和平均积分光密度高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）（表2、图1～图6）。