单胺氧化酶B在大鼠外周神经系统中的定位

陈　强，徐　洋

(吉林大学口腔医学院 口腔颌面外科，吉林 长春130021)



单胺氧化酶B在大鼠外周神经系统中的定位

陈强，徐洋*

(吉林大学口腔医学院 口腔颌面外科，吉林 长春130021)

摘要：目的研究单胺氧化酶B(MAOB)在大鼠外周神经系统中的表达，为进一步研究MAOB与外周神经系统中轴突运输和神经传导的关系提供形态学依据。方法采用免疫组织化学的方法，通过光镜和电镜观察MAOB在大鼠外周神经系统中的分布。结果光镜下，MAOB免疫反应阳性细胞分布在舌体的上皮及固有层中。电镜下，MAOB免疫反应阳性细胞分布在大鼠舌体有髓鞘和无髓鞘轴突中。阳性物质分布于细胞质中，准确来说为线粒体外膜上。结论MAOB在大鼠外周神经系统轴突的表达，提示MAOB可能与轴突的运输和神经传导有着非常重要的作用。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0713)

单胺氧化酶(MAO)是一种降解生物肽的酶[1]，分为两种亚型，单胺氧化酶A(MAOA)和单胺氧化酶B(MAOB)[2]。MAO-A对底物血清素(5-HT)、去甲肾上腺素 (NE)、多巴胺(DA)和抑制剂氯吉兰具有高度亲和性[3]；单胺氧化酶B是一种线粒体黄素蛋白酶，其作用主要为氧化脱氨，对苯乙基胺(PEA)、苯甲胺和抑制剂司来吉兰(deprenyl)具有高亲和性[4]。MAOB主要倾向于外源性胺的新陈代谢，如2-苯基乙胺，故其对酶作用物苯基乙胺以及抑制物司来吉兰有密切关系。因此，它可以作为大脑代谢屏障限制假神经递质进入中枢神经系统[5]。另外，MAOB还可以代谢大脑中的多巴胺，其抑制剂通常被用来治疗帕金森病[6,7]。之前研究证实，MAOB不仅存在于中枢神经系统，也存在于外周组织中，如肝脏、肾脏、脑、甲状腺等[8,9]。但MAOB主要存在于淋巴细胞和血小板中。

目前MAOB在中枢神经系统和外周器官的分布已经研究到了细胞甚至亚细胞水平，在外周神经系统的细胞及亚细胞的研究较少。在我们的研究中，通过免疫组化的方法确定大鼠外周神经系统MAOB存在，从而进一步探索MAOB与外周神经系统的关系。

1材料与方法

1.1　动物

清洁级正常健康雄性SD大鼠6只，体重180-200 g，购自吉林大学实验动物中心。所有实验过程遵循吉林大学动物实验原则，将大鼠使用数量及承受痛苦降到最低。为大鼠提供标准的食物和自来水。

1.2　初级抗体

MAOB起初是从牛的肝脏线粒体中提纯而来，用于制备兔抗MAOB抗血清[10]。在大鼠的脑中，这种抗血清可以通过免疫组化法将含有MAOB的细胞染色，而含有MAOA的细胞不着色。即这种抗血清特定的识别大鼠体内的MAOB。

1.3　免疫组化方法-低倍镜

根据之前的研究[11]，低倍镜下观察的MAOB的分布其免疫组化染色通常使用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物。

取3只大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(60 mg/kg)，待大鼠麻醉后，打开胸腔，左心室插管至升主动脉，先用pH7.4 0.01M磷酸缓冲液50 ml室温下冲洗，然后用含有4%多聚甲醛、0.3% 戊二醛和0.2%苦味酸的4℃ 0.1M的磷酸缓冲液300 ml灌注固定。灌毕后，立即取出大鼠舌体，将舌体再置入上述固定液中固定24 h。将舌体于低温培养箱中30 μm冠状切成切片，按以下程序培养：①含有0.3%聚乙二醇辛基苯基醚的磷酸缓冲液(PBS)中室温培养1 h；②含兔抗MAOB抗血清的PBS(1∶200 00)中4℃培养60 h；③于生物素化的羊抗兔免疫球蛋白G(1∶1 000)中室温培养2 h；④于亲和素-生物素-过氧化物酶复合物中室温培养2 h；⑤含有0.025% 3,3-二氨基联苯胺、0.6%硫酸镍按和0.006%过氧化氢的0.05 M的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(TRIS-HCl)缓冲液中室温培养2 min。待培养完成后，将标本用含有1%四氧化锇的0.1M的磷酸缓冲液4℃固定1 h，环氧树脂脱水包埋。置于光镜下观察其染色。

1.4　免疫组化方法-高倍镜

同样取3只大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(60 mg/kg)，待大鼠麻醉后，打开胸腔，左心室插管至升主动脉，先用pH 7.4 0.01M磷酸缓冲液50 ml室温下冲洗，然后用含有4%多聚甲醛、0.3%戊二醛和0.2%苦味酸的4℃ 0.1M的磷酸缓冲液300 ml灌注固定。灌毕后，立即取出大鼠舌体，将舌体再置入上述固定液中固定24 h。固定后，将舌体用显微用切片机50 μm冠状切成切片，并保存于0.1M的磷酸缓冲液中。

我们采用免疫酶法用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物对MAOB进行染色。染色方法如下：①含有0.001%胰蛋白酶(Ⅲ型)的磷酸缓冲液室温下5 min；②含有5%羊血清的磷酸盐缓冲液室温下1 h；③兔抗MAOB抗血清(1∶60 000)混合1%的正常羊血清4℃下48 h；④于生物素化的羊抗兔免疫球蛋白G(1∶1 000)中室温培养2 h；⑤于亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(1∶1 000)中室温培养2 h；⑥含有0.025% 3,3-二氨基联苯胺、0.6%硫酸镍按和0.006%过氧化氢的0.05 M的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(TRIS-HCl)缓冲液中室温培养10 min。待培养完成后，将标本用含有1%四氧化锇的0.1 M的磷酸缓冲液4℃固定1 h，环氧树脂脱水包埋，用超微切片机切片。切片用乙酸双氧铀和铅染色溶液染色，置于透射电镜下观察。

2结果

2.1　免疫组化-低倍镜

低倍镜下，在大鼠舌头的固有层中及上皮层中发现MAOB免疫阳性区，反应阳性区域成暗黑色(图1)。

图1光镜下大鼠舌上的MAOB的分布 MAOB免疫阳性区域位于上皮(EP，上箭头)及固有层(LP，下箭头)中。比例尺 50 μm

2.2　免疫组化-高倍镜

电镜下，我们发现有髓鞘轴突(图2A)和无髓鞘轴突(图3A)中存在MAOB免疫阳性区域。同时有髓鞘轴突的周边的施万细胞中也存在MAOB阳性区域(图2B)。在MAOB阳性结构中，我们发现MAOB免疫阳性物质存在于轴突的线粒体外膜及其周围。此外，并非所有的轴突线粒体外膜都呈阳性反应，部分有髓鞘轴突(图2B)、无髓鞘轴突(图3B)和施万细胞(图3C)中的线粒体外膜成免疫阴性。

3讨论

根据目前的研究，我们通过使用免疫组织化学的方法研究了一定数量的有髓鞘轴突和无髓鞘轴突。在电镜下，有髓鞘纤维轴突及无髓鞘神经纤维轴突中发现了大量的单胺氧化酶B阳性区域。阳性区域位于轴突内线粒体外膜及其周围。这就提出一个问题，是否MAOB不仅存在于线粒体外膜上而且还存在于线粒体外膜的周围。MAOB免疫组化阳性区域为二氨基联苯胺的氧化产物，通过亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法用过氧化物酶催化形成[12]。在免疫组化使用过氧化物酶于电镜观察时，二氨基联苯胺的氧化产物可以从原来抗原的位点上展开。此外，之前研究已经在大鼠肠嗜铬细胞证实MAOB显著存在于线粒体外膜上。因此，MAOB主要是位于线粒体外膜上。

图2A,B电镜下MAOB大鼠舌神经纤维的分布 MAOB免疫阳性区域位于有髓鞘轴突(A，大箭头)和施万细胞(B，大箭头)的线粒体外膜及周围。此外，部分有髓鞘轴突(A，B，小箭头)中的线粒体外膜呈阴性反应。比例尺 500 nm

图3A,B,C 电镜下， MAOB免疫阳性区域位于无髓鞘轴突(A，B，大箭头)和的线粒体外膜及周围。此外，无髓鞘轴突(B，小箭头)和施万细胞(C，小箭头)中的部分线粒体外膜呈阴性反应。比例尺500 nm

同时在有髓鞘和无髓鞘轴突中我们还发现并不是所有的线粒体呈现阳性特征。有的线粒体表面呈阳性表现，有一部分线粒体却成阴性表现。即一部分线粒体外膜上含有MAOB，另一部分线粒体外膜上没有这种酶。这种发现可能归因于一种或者更多的原因：①人为造成，切片将该区域破坏；②不均匀的固定破坏了线粒体外膜上酶的活性；③部分线粒体自身就缺少这种酶[13]。MAOB的基因在人和鼠中都位于X染色体上，在大鼠中MAOB编码在核基因，在细胞质的核糖体上合成。因此，MAOB在细胞质中合成某种方式转运到线粒体外膜上，其中任何一个环节出问题都可能导致MAOB的表达障碍。弄清楚这种表现不同的确切原因还需进一步深入研究。

单胺氧化酶B是典型的线粒体外膜上内嵌型酶，它在含多核糖体的细胞之内合成，负责儿茶酚胺类、血清素、生物胺等单胺类神经递质氧化脱氨基作用[14]。MAOB主要作用于B-苯乙胺，对选择性的抑制剂如丙炔苯丙胺敏感。在之前的研究中，已通过组织化学的方法证实了MAO存在于大鼠外周神经，即坐骨神经中，并证实了轴突外的MAO为生物胺的屏障系统。MAOB可代谢胺类神经递质，神经递质功能就是传导神经冲动，神经递质正常的的合成与降解对轴突之间神经冲动的传导有着重要的作用。本研究发现MAOB在大鼠外周神经轴突大量表达，为进一步探讨MAOB与轴突运输及神经传导的关系提供了形态学依据。

参考文献：

[1]Zhang Y,Xu Y,Tan S,et al.Rapid and sensitive fluorescent probes for monoamine oxidases B to A at low concentrations[J].Tetrahedron Letters,2012,53(51):6881.

[2]Edgnülü TG,Zge A,Erdal N,et al.Association Analysis of the Functional MAOA Gene Promoter and MAOB Gene Intron 13 Polymorphisms in Tension Type Headache Patients[J].Advances in clinical and experimental medicine:official organ Wroclaw Medical University,2013,23(6):901.

[3]Gong P,Xi S,Shen G,et al.The effects of DBH,MAOA,and MAOB on attentional biases for facial expressions[J].Journal of Molecular Neuroscience,2013,49(3):606.

[4]Shaban NZ,Masoud MS,Awad D,et al.Effect of Cd,Zn and Hg complexes of barbituric acid and thiouracil on rat brain monoamine oxidase-B (in vitro)[J].Chemico-biological interactions,2014,208:37.

[5]Youdim MB H,Edmondson D,Tipton KF.The therapeutic potential of monoamine oxidase inhibitors[J].Nature Reviews Neuroscience,2006,7(4):295.

[6]Teo KC,Ho SL.Monoamine oxidase-B (MAO-B) inhibitors:implications for disease-modification in Parkinson’s disease[J].Neurodegen,2013,2:19.

[7]Kaludercic N,Mialet-Perez J,Paolocci N,et al.Monoamine oxidases as sources of oxidants in the heart[J].Journal of molecular and cellular cardiology,2014,73:34.

[8]Torkaman-Boutorabi A,Shahidi GA,Choopani S,et al.The catechol-O-methyltransferase and monoamine oxidase B polymorphisms and levodopa therapy in the Iranian patients with sporadic Parkinson’s disease[J].Acta Neurobiol Exp,2012,72(3):272.

[9]Sun J,Ren J,Xu L,et al.Purification of monoamine oxidase B from porcine liver[J].S Chinese journal of chromatography,2010,28(9):872.

[10]Huang Y H,Jiang M,Fu BY.Immunocytochemical localization of monoamine oxidase type B in rat liver[J].European Journal of Histochemistry,2009,52(1):11.

[11]黄玉红,姜敏,孙明军,等.单胺氧化酶 B 在大鼠胃和十二指肠的分布[J].解剖科学进展,2011,17(3):236.

[12]Arai R,Karasawa N,Kurokawa K,et al.Differential subcellular location of mitochondria in rat serotonergic neurons depends on the presence and the absence of monoamine oxidase type B[J].Neuroscience,2002,114(4):825.

[13]Huang YH,Jiang M,Fu BY.Immunocytochemical localization of monoamine oxidase type B in rat liver[J].European Journal of Histochemistry,2009,52(1):11．

[14]Torkaman-Boutorabi A,Ali Shahidi G,Choopani S,et al.Association of monoamine oxidase B and catechol-O-methyltransferase polymorphisms with sporadic Parkinson’s disease in an Iranian population[J].Folia Neuropathol,2012,50(4):382.

关键词：单胺氧化酶B；有髓鞘轴突；无髓鞘轴突；外周神经系统；免疫组织化学

Immunocytochemical localization of monoamine oxidase type B in rat’s peripheral nervous systemCHENQiang，XUYang.(DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,SchoolofStomatologyofJilinUniversity，ChangchunCity，130021,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of monoamine oxidase type B (MAOB) in rat’s peripheral nervous system to provide morphologic basis for further study about MAOB and the relationship between axon transportation and nerve impulse transduction.MethodsThe present study used immunohistochemical method to observe the localization of MAOB in rat’s peripheral nervous system.ResultsLight microscopy reveals that MAOB immunoreactivity is presented in epithelium above the lamina propria and lamina propria of rat’s tongue.Electron microscopy reveals that MAOB immunoreactivity is found in the myelinated axons and unmyelinated axons.MAOB immunoreactivity is also observed in the Schwann cell.In these MAO-B-positive structures,MAOB immunohistochemical reaction products are found on and around the mitochondrial outer membrane.ConclusionThe abundeant MAOB in rat’s peripheral nervous system indicates that MAO-B plays a critical role in axon transportation and nerve impulse transduction.

Key words:monoamine oxidase B；myelinated axon；unmyelinated axon；peripheral nervous system；immunohistochemistry

(收稿日期：2014-08-09)

作者简介：陈强(1989-)，男，在读研究生，硕士，研究方向：MAOB的定位分析。

文献标识码：A

中图分类号：R392.11

文章编号：1007-4287(2015)05-0713-04

*通讯作者