免疫荧光染色法检测结核分支杆菌的建立与临床应用

杨江华，朱晓玥，王文节

(皖南医学院弋矶山医院 感染性疾病科，安徽 芜湖241001)



免疫荧光染色法检测结核分支杆菌的建立与临床应用

杨江华，朱晓玥，王文节

(皖南医学院弋矶山医院 感染性疾病科，安徽 芜湖241001)

摘要：目的建立免疫荧光染色法特异性检测结核分支杆菌，提高痰涂片阴性肺结核患者的诊断率。方法随机选取浸润型肺结核患者57例作为实验组，其中痰涂片抗酸染色阳性患者28例，痰涂片阴性患者29例；对照组13例，为呼吸道其它细菌感染者。受检者晨起留取痰液，高温高压后与标本等量的5%次氯酸钠溶液混合，离心后分别行直接涂片抗酸染色检查或免疫荧光染色法检查。结果57例浸润型肺结核患者中，28例痰涂片抗酸染色检查阳性，免疫荧光染色法检测仍阳性；在29例痰涂片阴性肺结核患者中，免疫荧光染色法检测15例阳性。13例呼吸道其他细菌感染者者经免疫荧光染色法检测与抗酸染色均为阴性。结论免疫荧光染色法检测结核分枝杆菌具有特异性，显著提高痰菌阴性肺结核的诊断率。

(ChinJLabDiagn,2015,19:0775)

结核病已经成为我国重大的传染病之一，是严重危害人类健康的呼吸道传播疾病。据WHO的数据统计报告，我国不仅仅是世界范围内22个结核病流行最严重国家之一，同时也是27个耐结核病药物流行严重的国家之一。目前，我国结核病的年发病人数高达130万，约占全球发病人数的14.3%，位居全球的第二位。根据我国第五次结核病流行病学的抽样调查结果显示，2010年15岁及以上肺结核人群的患病率为459/10万，其中传染性肺结核患病率为66/10万。因此，结核病已经成为我国危害人们健康最严重的呼吸道传染病。结核病防控重要措施之一在于结核病的诊断，尤其是对痰涂片阴性肺结核的诊断率意义尤为重大。因此建立简便，快捷，特异的痰菌阴性结核病诊断方法成为控制结核病蔓延的首要任务。本研究拟建立了特异性免疫荧光染色法( immunofluorescence assay，IFA)检测结核分枝杆菌，以期提高肺结核，尤其是痰菌阴性肺结核的诊断率。

1材料与方法

1.1病例选择选取浸润型肺结核患者57例，其中痰涂片抗酸染色阳性患者28例，痰涂片阴性患者29例。符合2001年中华医学会结核病学分会制定的《肺结核诊断和治疗指南》[1]诊断标准。收集患者相关资料如临床症状、体征、血常规、血生化，细菌学以及影像学结果等。对照组13例，通过细菌学检查诊断为其它细菌性肺炎患者。

1.2直接涂片抗酸染色检测嘱患者连续3 天晚上睡觉前清水漱口，次日清晨再次用生理盐水漱口，咳出深部痰液，合格标本量不少于1 ml，留于洁净标本瓶中，高压灭菌后加入与标本等量的5%次氯酸钠溶液，采用振荡器混匀，混合10 min，倒入洁净离心试管中，以3 000 r/min，离心10 min，弃去上部液体，将剩余沉渣0.1 ml放入载玻片中央处，然后将其均匀涂抹为卵圆形痰膜，让其自然干燥；后痰涂片火焰固定，置于染色架上；加染色剂浸满痰膜，微火加温染液，染色5-10 min，水洗；加脱色剂脱色3-5 min，至无红色，然后水洗，自然凉干，显微镜下检测，结果报告的标准参照文献[2]。

1.3免疫荧光染色法检测痰标本经5%次氯酸钠溶液消化10 min,倒入洁净离心试管中,以3 000 r/min,离心10 min，将上部液体弃去，1 ml PBS清洗1次，沉淀物加0.5 ml PBS，再加入1 μl荧光标记抗抗酸杆菌抗体(Abcam公司产品)，4 ℃孵育30 min，离心，用PBS重悬，离心，取出将上部液体弃去,剩0.1 ml放入载玻片中央处，荧光显微镜下观察。

2结果

57例浸润性肺结核患者痰涂片抗酸染色检查，28例痰涂片抗酸染色阳性表现为细菌为红色，呈短棒状或杆状痰标本；但部分标本因坏死组织较多及细菌存在于细胞内，严重干扰检测者的判断(图1 A)；痰标本经5%次氯酸钠溶液消化后，背景消失，视野清晰(图1 B)。28例抗酸染色阳性患者行免疫荧光染色检查仍阳性，荧光染色镜检表现为结核分枝杆菌在暗色背景下会发出黄绿色荧光，非常醒目，容易辨认(图2 A)；29例直接涂片抗酸染色检查阴性，经免疫荧光染色15例检查阳性(图2 B)。13例普通细菌性肺炎患者痰液涂片抗酸染色与免疫荧光染色方法检查，均未发现抗酸杆菌。

图1　 肺结核患者痰涂片直接抗酸染色阳性以及5%次氯酸钠溶液消化后抗酸染色。

3讨论

当前我国在结核病控制方面首先面临的问题是结核病的诊断，尤其是痰涂片阴性肺结核患者的诊断。肺结核的实验室诊断方法主要有影像学检查、细菌学检查、免疫学检查以及分子生物学检查等[1]。细菌学检查依然是目前被认为肺结核诊断的金标准，主要有痰涂片抗酸染色直接找结核分枝杆菌以及结核分枝杆菌培养方法。传统的痰涂片抗酸染色检查方法虽然操作简单，但有其阳性率较低之不足。结核分枝杆菌培养法虽然敏感性较高，但存在培养时间长，成本高，以及需要特殊设备，重复性尚差的缺点。为此，本实验对传统痰涂片抗酸染色方法进一步改进，5%的次氯酸钠作为液化剂而使用。次氯酸钠不仅具有灭菌的特性，也可以起到很好的生物安全防护作用，同时还可以最大限度的使痰标本中抗酸杆菌浓集，破坏痰中杂菌以及坏死组织与细胞等，从而减少痰液中杂质对染色的干扰。这些都有利于结核菌检出率的提高。

图2　痰涂片抗酸染色阳性及阴性肺结核患者免疫荧光染色。

免疫荧光法是建立在生物化学、免疫学和荧光显微镜技术的基础上建立起来的一项标记检验技术。其原理为将不影响抗原抗体活性的荧光素直接标记到抗体上面，与样本中相应的特异性抗原结合，然后在荧光显微镜下观察呈现特异性荧光成像。由于免疫荧光法既不要求菌体是否有活力，也不需要进行细菌的培养，因此具有显著的临床应用前景。与其它快速检测方法相比而言，此技术的特异性好、敏感性高、操作简单、是快速检测的首选方法之一。由于免疫荧光法操作简便，操作时间短，因此在临床上用于快速诊断传染性疾病具有明确优势。同时高质量特异性抗体的应用也大大减少了非特异荧光染色的干扰，使该法敏感性和特异性得到进一步提高。在本次试验中，我们选用的Abcam公司以PPD为免疫原FITC标记的多克隆抗体，能够特异性检测结核分枝杆菌[3]。而国内多数研究选用金胺O荧光染色,为非特异性染色剂[4]。从本次试验结果的分析可见， 我们使用20倍物镜对标本进行观察，阳性标本即可显现明亮的荧光颗粒，这不仅使结果判定更加直接、方便，而且由于观测面积的扩大，使菌量较少的标本也可以被检测出。在方法的应用、推广方面，相对传统的抗酸染色，其操作过程更简单，设备方面除荧光显微镜外，其它都是临床检验科常规实验所必须的，惟一不同的是需要结核分枝杆菌特异性的抗体。如果该方法规范、成熟后，有商品化特异性的标记抗体出现，从而使该方法的操作更加简单、快捷，且较抗酸染色更易于标准化，可广泛应用于肺结核患者的临床检测。

我们在该项研究中采用次氯酸钠联合免疫荧光法检测结核分枝杆菌与抗酸染色进行平行对比实验，检测结果明确，这一点不仅体现在检出的阳性率方面免疫荧光染色法要高于抗酸染色，还在于它们之间的阳性标本的吻合率以及特异性上。因此，从我们的实验结果分析，免疫荧光染色法要优于抗酸染色法。由此，该方法将有助于提高痰涂片阴性肺结核的诊断效率，还可用于结核性脑膜炎、结核性脓肿等的诊断，能够推广使用。

参考文献：

[1]中华医学会结核病学分会.肺结核诊断和治疗指南[J].中华结核和呼吸杂志,2002,24(2):70.

[2]中国防痨协会.结核病细菌性检验规程[J].中国防痨杂志,1996,18(1):28.

[3]Verway M1,Bouttier M,Wang TT,et al.Vitamin D induces interleukin-1β expression:paracrine macrophage epithelial signaling controls M.tuberculosis infection[J].PLoS Pathog,2013,9(6):e1003407.

[4]齐兴峰,曾德华,郑智勇.金胺O荧光染色和抗酸染色在结核病诊断中的联合应用[J].临床与实验病理学杂志,2010,26(6):763.

关键词：肺结核；抗酸染色；免疫荧光

The establishment and clinical application of immunofluorescent staining method to detect mycobacterium tuberculosisYANGJiang-hua,ZHUXiao-yue,WANGWen-jie.(DepartmentofInfectiousDiseases,YijishanHospital,WannanMedicalCollege,Wuhu241001,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method of immunofluorescence assay to detect acid-fast bacilli,and to improve the diagnostic rate of sputum-negative pulmonary tuberculosis patients.Methods57 infiltrative pulmonary tuberculosis patients were collected,and the control group was 13 patients with bacterial pneumonia．Direct sputum smear acid-fast staining or immunofluorescence assay was adapted.Results28 sputum-positive pulmonary tuberculosis patients used acid-fast staining were all positive to immunofluorescence assay.15 of 29(15/29)sputum-negative pulmonary tuberculosis patients used acid-fast staining were positive to immunofluorescence assay.13 patients with bacterial pneumonia patients were all negative to immunofluorescence assay.ConclusionImmunofluorescence assay with specificity significantly improved the diagnostic rate of sputum-negative pulmonary tuberculosis patients.

Key words:Pulmonary tuberculosis;immunofluorescence assay;acid-fast staining

(收稿日期：2014-08-15)

作者简介：杨江华，男，博士，副主任医师，研究方向：感染与免疫。

文献标识码：A

中图分类号：R521

文章编号：1007-4287(2015)05-0775-03

基金项目:安徽省卫生厅基金项目(No.09A002)与省级大学生创新训练项目( AH201310368067)