采用响应曲面法优化红曲霉发酵培养基组分

周建建，苏 理，，赵双枝 ，张彦昊，郭宏明

(1.山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南250353;2.山东省食品发酵工程重点实验室，山东济南250013;3.泰兴市一鸣生物制品有限公司，江苏泰兴225433)

红曲在我国的生产和应用源远流长，已经有上千年的历史，而采用现代科学方法研究红曲却始于1884年法国生物学者Van Tidghen从马铃薯培养基上分离纯化得到两种红曲霉菌株开始，印尼学者Went 1895年对紫红曲菌种进行了菌种鉴定［1］。红曲红色素是红曲霉次级代谢产物色素的一种，是目前唯一一种利用微生物发酵制备的天然药食两用色素。红曲红色素符合食品着色剂“营养、天然、多功能“的发展要求和方向，因此值得大力应用和推广［2］。随着科学技术的高速发展，人工合成色素的弊端日益显露，加之人类生活水平的提高和医学水平的进步，人们越来越倾向于使用天然化的食品及化妆品，可见天然色素的用量将会继续增加。如何提高液态深层发酵法红曲红色素的产量及质量是当前科研工作者面临的一个重大难题。本研究旨在优化红曲霉1001的发酵培养基配方，以期为工业化大规模生产提高参考，以推广我国的红曲产业，因此本论文的研究具有积极深远的意义［3］。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红曲霉1001 山东省食品发酵工业研究设计院实验室保藏;乳酸 天津市永大化学试剂开发中心;琼脂 北京奥博星生物科技有限责任公司;豆粉 石家庄泰富豆饼粉厂;蔗糖 广东光华化学厂有限公司;KH2PO4山东荆河日用化工有限公司;NaNO3廊坊鹏彩精细化工有限公司;MgSO4莱州市莱玉化工有限公司;麦芽糖、可溶性淀粉 天津市科密欧化学试剂有限公司;酵母膏、蛋白胨(BR) 北京奥博星生物科技有限责任公司;葡萄糖(食品级) 山东西王集团;大米粉 长沙米粉公司;玉米浆 鲁洲生物技术(山东);斜面培养基(g/L) 麦芽糖40.00，可溶性淀粉40.00，蛋白胨 35.00，琼脂 20.00，pH 自然，0.1MPa 灭菌20min;基本种子培养基(g/L) 大米粉40.00，豆粉2.32，NaNO38.36，KH2PO42.50，MgSO41.00，乳酸调 pH至3.8～4.2，0.1MPa灭菌20min;基本发酵培养基(g/L)大米粉 85.00，KH2PO42.00，NaNO30.05，MgSO41.00，pH5.5～6.0，0.1MPa 灭菌20min。

表1 Plackett－Burman实验设计Table 1 Plackett－Burman experimental design

独轴旋转式摇瓶机 无锡市锡山制锁设备厂;JA 12002电子天平、雷磁PHS－3C PH计 上海精科精密科学仪器有限公司设备厂;752型紫外分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;电热恒温培养箱山东潍坊精鹰医疗器械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法 斜面培养:33℃，培养10～15d;种子培养:500mL 三角瓶，装液量70mL，33℃，200r/min，培养24h;摇瓶发酵:500mL三角瓶，装液量70mL，接种量 6%，33℃，180r/min，培养 120h。

1.2.2 黄豆粉水解液的制备方法 10%黄豆粉碱性水解液的制备:称取所需的黄豆粉，加水定容并用NaOH调pH至9.0～9.5，于0.1MPa下处理30min，配料时用盐酸调至中性，然后直接加到原料中即可。黄豆粉酸性水解液的制备:称取所需的黄豆粉，按照固液比3∶1加入1mol/L的盐酸，于0.1MPa下处理30min，配料时用氢氧化钠调至中性，然后直接加到原料中即可。

1.2.3 红曲红色素的测定方法 按照中国国家标准局2005年颁布的《中华人民共和国国家标准食品添加剂红曲红》(GB15961－2005)测定［4］。

1.2.4 发酵培养基配方的优化 不同碳源、氮源、无机盐及生长因子的筛选，均采用单因素实验。

1.2.4.1 不同碳源对色素产量的影响研究 红曲霉发酵生产红曲红色素主要以大米粉为基本介质，因此在研究碳源对红曲红色素产量的影响时，保留了大米粉，另外增加了其它类型的碳源。添加其他碳源的目的在于使红曲霉发酵前期能够快速增殖，从而缩短发酵周期。为了确定红曲霉1001产红曲红色素的最佳碳源，分别选取60g/L的葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、红薯淀粉、麦芽糖及甘油作为发酵培养基中的碳源，其他成分均采用基本发酵培养基的配方。

1.2.4.2 不同氮源对色素产量的影响研究 氮源主要用于构成菌体细胞物质(氨基酸、蛋白质和核酸等)和含氮代谢物，因此是菌体生长代谢所必需的。常用的氮源可分为两大类:有机氮源和无机氮源。

为了得到红曲霉1001发酵培养基的最佳氮源，分别选用0.50g/L的无机氮源氯化铵、硝酸铵、谷氨酸钠、硝酸钠、硫酸氨和10.00g/L的有机氮源酵母粉、牛肉膏、黄豆粉、黄豆粉酸、碱性水解液、酵母膏、蛋白胨等为氮源，以发酵液中红曲红色素的色价为主要指标，考察氮源种类对红曲霉1001发酵的影响。

1.2.4.3 不同无机盐对色素产量的影响研究 无机盐在微生物的生长代谢过程中是一类不可缺少的微量物质，能够维持微生物的正常生理活动。微生物的合成需要多种无机盐，这些无机盐离子作为底物降解的辅助因子，作为酶的组成成分或维持酶的活性，或构成菌体原生质体的成分(磷、硫等)。K+和Mg2+就是这方面两个最常见的因素。加入的有关化学试剂中，首选的是KH2PO4和MgSO4，因为它们可以提供四种需要量最大的元素。选取不同浓度的KH2PO4、MgSO4考察红曲霉1001对无机盐的利用情况。此外，还添加了FeSO4、ZnSO4及其组合考察红曲霉1001对Fe2+、Zn2+的利用情况。

1.2.4.4 生长因子对色素产量的影响研究 生长因子是微生物生长必需的物质，虽然需要量不大，但却是必需的，它的作用就是让微生物能正常生长。选取玉米浆考察生长因子对红曲霉1001发酵生产的影响。

1.2.4.5 响应面实验 根据单因素实验的结果，运用Plackett－Burman设计法，最陡爬坡实验以及Box－Benhnken Design设计法进行培养基的优化。Plackett－Burman实验设计见表1。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对色素产量的影响

碳源是发酵培养基中最重要的成分之一，为菌体的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的成分。由图1可知，不同碳源对于红曲霉1001产色素影响很大，以葡萄糖为碳源时发酵液色价最高可达190U/mL，明显优于其它碳源，故选定葡萄糖为最佳碳源。

图1 不同碳源对色素产量的影响Fig.1 Effect of different carbon sources on pigments content

2.2 不同氮源对色素产量的影响

在培养基中合理地加入不同氮源，有利于缩短红曲霉生长时间，提高色素的产量。实验结果见图2。由图2可知，有机氮源发酵产红曲红色素的色价普遍高于无机氮源发酵产红曲红色素的色价，并且在无机氮源中硝酸钠发酵产红曲红色素的色价是最高的，在有机氮源中蛋白胨发酵产红曲色素的色价是最高的，黄豆粉次之。但从经济角度出发，黄豆粉更适合作有机氮源。

图2 不同氮源对色素产量的影响Fig.2 Effect of different nitrogen sources on pigments content

为了确定有机氮源和无机氮源之间的相互协调作用，选取色价相对较高的有机氮源黄豆粉和蛋白胨以及无机氮源硝酸钠进行相互组合。实验结果如图3，由此可见黄豆粉与硝酸钠的组合要好于蛋白胨与硝酸钠的组合，因此选取黄豆粉与硝酸钠为最佳氮源。

图3 有机氮源和无机氮源组合对色素产量的影响Fig.3 Effect of combination of organic nitrogen and inorganic nitrogen sources on pigments content

2.3 无机盐对色素产量的影响研究

2.3.1 KH2PO4对色素产量的影响研究 不同浓度的KH2PO4对红曲色素的影响如图4所示，随着KH2PO4浓度的增加，红曲色素的色价在增加，当KH2PO4的浓度在2.00g/L时，红曲色素的色价最高，达到221.00U/mL，但如果KH2PO4的浓度继续增加，则红曲色素的色价会降低。磷酸盐浓度可以显著的影响菌体细胞的生长和红曲色素的形成。

图4 不同浓度KH2PO4对色素产量的影响Fig.4 Effect of different concentrations of KH2PO4on pigments content

2.3.2 MgSO4对色素产量的影响 文献报道，添加适量的MgSO4对细胞的生长和产物的形成都有影响，由图5可以看出，添加1.00g/L的MgSO4与不添加者相比，红曲红色素的产量提高近77%，达到235.00U/mL。Mg2+对红曲红色素的生成有明显的促进作用，最佳浓度1.00g/L。镁离子浓度超过0.15%时又会对色素的产生有不利的影响。因此选择1.00g/L的MgSO4作为发酵培养基的基本成分。

图5 不同浓度MgSO4对色素产量的影响Fig.5 Effect of different concentrations of MgSO4on pigments content

2.3.3 FeSO4、ZnSO4及其组合的影响 据文献报道［5］，Fe2+、Zn2+对红曲霉的生长代谢均有影响。根据 MgSO4的研究结果，宜选取 FeSO4、ZnSO4为1.00g/L，1.00g/L FeSO4+1.00g/L ZnSO4为组合，结果见图6。从图6中可以看出，含ZnSO4的组分要高于对照组，FeSO4+ZnSO4低于对照组，而含FeSO4的组分要远远低于对照组，这说明Zn2+能够促进红色素的合成，而Fe2+却能够抑制红色素的合成。因此，培养基中应添加适量的Zn2+。

图6 FeSO4、ZnSO4及其组合对色素产量的影响Fig.6 Effect of FeSO4、ZnSO4 and combination of them on pigments content

2.4 玉米浆对色素产量的影响研究

玉米浆除了作为红曲霉发酵的氮源外，还因其含有大量的微量元素，对微生物发酵有促进作用。由图7可以看出，当玉米浆浓度大于3.50g/L，红曲红色素的色价基本不变，在培养基中加入3.50g/L的玉米浆，红曲红色素的色价明显提高，由235.00U/mL上升为285.00U/mL。

2.5 Plackett－Burman 实验

根据单因素实验选取对红曲红色素有影响的8个因素，每个因素选高低2个水平，以发酵液红曲红色素的色价作为响应值。另外选择3个虚拟项，以考察实验误差，共11个因素，每组实验重复3次，取3次的实验平均值。选取N=11的Plackett-Burman设计对发酵培养基中的8个组分的重要性进行考察，实验设计及结果见表2。运用Design Expert7.0对实验结果进行分析，比较各因素对红曲霉1001产红曲红色素的影响。

表2 Plackett－Burman实验设计及实验结果Table 2 Plackett－Burman experimental design and experimental results

表3 各因素重要性排序和效应值Table 3 The order of importance and the value of various factors

表4 各因素对色素产量影响情况表Table 4 Table of various factors on pigments content

图7 不同浓度玉米浆对色素产量的影响Fig.7 Effect of different concentrations of corn syrup on pigments content

由表3可以得出，C、A、H、G对提高红曲红色素的产量有显著正效应，F、D、E、B则具有负效应。其中G、B、H、E对结果的影响很小，A对结果影响较大，而F、D、C对结果的影响最大。

由表4可知，该模型的p=0.0025≪0.0500，仅有0.25%的概率不能用该模型来解释，A、C、D、F、H的p值均小于0.05，说明因素对模型影响显著。预测R2=0.9947也能合理地说明校正决定系数的变化。总之，该模型能够很好地表明各因素的变化情况。在本实验中，对红曲红色素有极显著影响的因素包括KH2PO4、黄豆粉、NaNO3。其中黄豆粉有显著正效应，KH2PO4、NaNO3有显著负效应。因此，后面的实验主要考察了这3个因素，且应适当增加黄豆粉含量，减少KH2PO4、NaNO3的含量。

2.6 最陡爬坡实验

响应面拟合方程只有在考察的临近区域内才能够更接近真实情形，在其他区域内拟合方程与被近似的函数方程毫无关系，毫无意义可言，不值得应用［6］。因此，首先逼近最佳值区域才能够建立有效的响应面拟合方程。最陡爬坡法是以实验值变化的梯度为爬坡方向，根据各个因素效应值的大小来确定变化步长，更快捷地逼近最佳值区域，从而可以确定主要影响因素的变化水平［7］。根据Plackett－Burman实验分析的结果筛选出影响红曲红色素的显著因素，并以各显著因素的正负效应确定下一步实验的最陡爬坡路径(包括变化方向和变化步长)，快速的逼近最佳值区域。由Plackett－Burman实验结果可知，在红曲霉1001产红曲红色素的液体发酵中，KH2PO4、NaNO3及黄豆粉这三个因素有显著影响，其中，黄豆粉有显著正效应，应向增加用量的方向爬坡;KH2PO4，NaNO3有显著负效应，应向减少用量的方向爬坡。根据这三个因素效应大小的比例设定它们的变化方向及步长进行实验，实验设计及结果如表5。

表7 Box－Benhnken Design实验回归模型方差分析表Table 7 Box－Benhnken Design experiments regression model variance analysis table

表5 最陡爬坡实验设计及实验结果Table 5 Steepest ascent experimental design and experimental results

由表5可知，第3组的色价最高，因此以第3组条件为中心点进行响应面分析。

2.7 Box－Benhnken Design实验

Box－Benhnken Design设计法是一种利用合理的实验设计并通过得到的实验数据，采用多元二次方程来拟合因素和响应值之间的函数关系，以对回归方程进行分析来寻求最优的组合，从而解决多变量问题的统计学方法［8］。根据PB实验及最陡爬坡实验的结果来确定Box－Benhnken Design实验的因素及水平。以KH2PO4、NaNO3和豆粉三个重要因素为自变量，考察这三个因子的相互作用和最佳水平。根据中心复合实验设计原理，设计3因素3水平共15个实验点的响应面分析实验，在中心值重复3次实验，Box－Behnken实验设计及实验结果见表6。

由表7可知，“Prob＞F”小于0.0500就意味着模式可行，在本实验中，在模型的各参数中，除A、BC和C2对红曲色素无影响外，其他各项均有显著的影响(可信度＞90%)。方程因变量与自变量之间的线性关系明显，失拟项0.0562＞0.05，失拟项不显著。该模型R2=96.41%，说明该模型与实验拟合较好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于该反应的理论推测。由F检验可以得到各因素效应值大小排序为:C＞B＞A，即黄豆粉＞NaNO3＞KH2PO4。通过软件对实验数据进行二次多项式回归拟合，获得产红曲色素对编码KH2PO4、NaNO3和黄豆粉多元回归方程为:色价(Y)=417－8.87A+9.75B+10.38C－27AB －13.75AC+0.50BC－39.13A2－20.88B2+3.38C2。

表6 Box－Behnken实验设计及实验结果Table 6 Box－Behnken experimental design and experimental results

根据上述回归方程及回归模型方差分析表绘出双因子效应分析图见图8～图10。各因素及其交互作用对响应值的影响结果可通过该组图直观反映出来，分别显示了三组以红曲红色素的色价为响应值的趋势图，从等高线图可以直观的反映出两变量交互作用的显著程度，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形与之相反。由红曲色素响应面三维图可以看出，黄豆粉、NaNO3、KH2PO4这三个因素均能形成较好的交互作用关系。

图8 KH2PO4与NaNO3交互影响红曲红色素产量的曲面图Fig.8 Response surface plot for the effects of KH2PO4and NaNO3on Red yeast rice content

图9 KH2PO4与黄豆粉交互影响红曲红色素产量的曲面图Fig.9 Response surface plot for the effects of KH2PO4and soybean powder on Red yeast rice content

图10 NaNO3与黄豆粉交互影响红曲红色素产量的曲面图Fig.10 Response surface plot for the effects of NaNO3and soybean powder on Red yeast rice content

应用响应面寻优分析方法对回归模型进行分析，寻找最优响应结果为:KH2PO4为1.52g/L，NaNO3为0.51g/L，黄豆粉为35.00g/L时，响应面最优值为439.074U/mL。在响应面分析法优化的最佳条件下进行3次平行实验，得到红曲色素的色价平均值为437.73U/mL，预测值与实际测量值非常接近，说明响应值的实验值与回归方程预测值吻合良好，比优化前色素色价提高了1倍。

3 结论

3.1 本文在基本发酵培养基的基础上，采用单因素实验，对碳源、氮源、无机盐及生长因子进行了筛选，筛选得到了发酵培养基的基本成分:大米粉、葡萄糖、黄豆粉、KH2PO4、NaNO3、MgSO4、玉米浆。

3.2 采用Plackett－Burman实验设计从7种红曲霉发酵培养基组分中筛选出了三种最为重要的影响因素，分别为:黄豆粉、KH2PO4、NaNO3。为了以最合理简便的方法寻找响应面实验的中心点，采用最陡爬坡实验逼近中心点，结果表明最优的中心点为KH2PO42.00g/L、NaNO30.4g/L、黄豆粉 25.00g/L。进一步采用Box－Benhnken Design响应面方法分析，得出回归模型存在最大值点，此时为 KH2PO41.52g/L，NaNO30.51g/L，黄豆粉35.00g/L，红曲红色素色价平均为437.73U/mL，比优化前提高了1倍。

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