酶解法提取紫玉米多糖技术的研究

2012-12-05魏俊青刘晓娟肖春玲

食品工业科技 2012年23期

魏俊青，刘晓娟，肖春玲

(山西师范大学工程学院，山西临汾041004)

玉米是世界上产量最高的粮食作物，作为活性多糖的提取原料，它具有明显的优势［1］。紫玉米因其独特的色泽和丰富的营养，成为玉米家族中非常珍稀的品种，其含活性糖量比普通玉米高很多，是提取多糖很好的原料。玉米多糖(corn polysaccharide)具有预防便秘、抗肿瘤、减肥降脂、清热利胆、调节免疫及预防癌症等作用［2］，可作为保健食品或保健食品的原料使用，所以越来越受到人们的关注。目前对玉米多糖的研究只是局限于普通玉米的玉米须、玉米皮、玉米芯［3］、玉米花粉和玉米花丝中的多糖等［4］，还没有见到关于从紫玉米中提取多糖的报道。大量资料表明，目前多糖的提取主要采用热水浸提、碱浸提、酸浸提等化学方法［5］。随着生物技术的发展，酶的来源愈来愈多［6］。本研究主要用酶解法提取紫玉米多糖，以期为紫玉米的进一步开发利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

紫玉米 2011年9月7日摘采于山西农业科学院玉米研究所;纤维素酶(30u/mg)、果胶酶(50u/mg)、木瓜蛋白酶(300wu/mg) 购于华科生化试剂商城，均为日本原装进口;无水葡萄糖标准品;无水乙醇、95%的乙醇、浓硫酸、苯酚为分析纯。

UV－1100型紫外－可见分光光度计上海隆拓仪器设备有限公司;FA－1004型电子天平上海精科实业有限公司;pHS－3TC精密数显酸度计上海沪粤明科学仪器有限公司;RJ－TDL－40C低速离心机上海比朗仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶解法提取紫玉米多糖紫玉米粒在65℃下烘干后磨粉，过40目筛，称取0.5g置于25mL蒸馏水中混匀。在紫玉米粉的浑浊液中加3mL的酶溶液于水浴锅中反应2h后将温度调至90℃，静置30min促使酶钝化。然后在3000r/min的条件下离心10min，取出上清液，加入95%的乙醇，静置一晚上，使其充分沉淀［7］。吸出上清液，将剩下的液体在3000r/min的条件下再次离心15min。沉淀用无水乙醇洗涤，干燥后就可以得到粗多糖，称其质量［8］。最后，将粗多糖溶解稀释，测其吸光度。

1.2.2 多糖含量的测定紫玉米粉多糖的含量采用苯酚硫酸法［9］。以葡萄糖标准溶液为标准品。建立的回归方程为:y=0.0567x－0.0032(0～14μg/mL，R2=0.9998)，其中y表示吸光度，x表示葡萄糖浓度。多糖的得率(%)=粗提物中含有的多糖质量/最初紫玉米粉的质量×100。

1.2.3 选择酶类型选用果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶，采用单一加入［10］、混合加入和分步加入的组合方法［11］，在同一条件下对相同的样液进行处理，得出最佳的酶组合。通过所购买的酶的说明介绍得知纤维素酶的适宜温度为45～60℃，pH为4.0～5.5;果胶酶的适宜温度为45～50℃，pH为3.0～6.0;木瓜蛋白酶的适宜温度为60℃左右，pH为4.5～7.0。为了保证3种酶在实验中的活性，综合考虑它们的适宜条件，选择50℃、pH5.0为酶解液的条件［12］。然后按照步骤1.2.1进行实验。

1.2.4 酶法提取多糖在3个样液中分别加入3种不同的酶液各3mL来提取多糖;混合酶法提取紫玉米多糖:混合酶是由这3种酶各1mL混合，再加入到样液中用来提取多糖;分步酶法提取多糖:1mL纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶依次加入同一个样液进行处理来提取多糖［10］。

1.2.5 紫玉米提取工艺的优化在不同pH、酶解温度、酶解时间、酶浓度［13］单因素实验结果的基础上，用Design－Expert 8.0软件对其中重要的3个因素进行响应面分析，进一步优化紫玉米多糖的提取工艺参数。各因素水平及编码见表1所示。

表1 实验因素水平及其编码Table 1 Factors and levels of response surface experiment

2 结果与分析

2.1 酶种类的选择

图1为3种不同类型酶的单一提取法、混合提取法和分步提取法得出的紫玉米多糖的得率。由图1看出，分步酶法具有一定的优势。因此，在后面的实验中选择用分步酶法来进行多糖的提取实验。

2.2 分步酶组合提取紫玉米多糖的单因素实验

2.2.1 不同pH对紫玉米多糖得率的影响固定酶浓度0.03mg/mL、酶解温度50℃、酶解时间2h［14］的条件下，分别采用不同的酶解 pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，按1.2.1操作，研究提取多糖的最适pH。结果见图2。由图2看出，紫玉米多糖的得率在pH5.5时最大，pH继续增大得率反而下降，酶对pH的变化表现出很高的敏感度，如果酶反应的pH偏离了某个适宜范围，活性就会降低。据此，选出的最适pH为5.5。

图1 不同种类酶对紫玉米多糖得率的影响Fig.1 Yields rate of polysaccharide of using different enzymatic hydrolysis

图2 pH与紫玉米多糖得率的关系Fig.2 Relationship of enzymatic hydrolysis of pH and the yield rate of polysaccharide

2.2.2 不同酶解温度对紫玉米多糖得率的影响固定酶浓度为0.03mg/mL、pH5.5、酶解时间2h的条件下，分别采用不同的酶解温度30、40、50、60、70、80℃，按1.2.1操作，研究提取多糖的最佳温度。结果见图3。由图3看出，温度在60℃时得率最大，而后随着温度的继续升高，得率反而降低。可能是因为温度除了影响反应中多糖的浸出速度，而且还影响着加入的酶的活性的大小。温度升高，酶活性增加，促使多糖溶出。但是超过60℃后，酶活性可能会降低，继续升高温度，甚至会丧失活性，表现为得率降低。因此紫玉米多糖的最佳酶解温度为60℃。

图3 酶解温度与紫玉米多糖得率的关系Fig.3 Relationship of temperature and the yield rate of polysaccharide

2.2.3 不同的酶解时间对紫玉米多糖得率的影响固定酶浓度0.03mg/mL、pH5.5、60℃的条件下，分别采用不同的酶解时间 1、2、3、4、5、6h 研究提取多糖的最佳时间。按1.2.1操作，由图4看出，多糖的得率随着酶解时间的延长呈现出上升的趋势，当时间为3h时，得率最高，继续延长时间，得率反而下降。分析原因，可能是酶的量在逐渐减少，不足以维持反应的进行。通过对实验结果的分析，而且考虑到时间的效率和有限性，最后选择3h为最佳酶解时间。

图4 酶解时间与紫玉米多糖得率的关系Fig.4 Relationship of extraction time and the yield rate of polysaccharide

2.2.4 不同酶浓度对紫玉米多糖得率的影响固定pH5.5、60℃、3h的提取条件，分别采用不同的酶浓度0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL，以确定最佳的酶浓度。按1.2.1操作，结果见图5。由图5看出，多糖得率在酶浓度为0.03mg/mL时最大，然后又出现回落趋势。通过实验结果，可得最佳酶浓度为0.03mg/mL。

图5 酶浓度与紫玉米多糖得率的关系Fig.5 Relationship of enzyme dosage and the yield rate of polysaccharide

2.3 响应面优化

2.3.1 响应面优化设计结果综合上述的实验结果，当最适酶浓度在0.03mg/mL附近时，它的变化对多糖的得率没有引起太大的影响，因此选择对多糖得率产生影响较大的pH、酶解温度和酶解时间，进行响应面实验设计。并应用软件Design Expert 8.0来分析处理数据，实验结果见表2。

利用Design－Expert 8.0软件对该实验结果进行响应面分析，通过回归拟合，得到了pH(X1)、酶解温度(X2)、酶解时间(X3)这3个因素与紫玉米多糖得率Y的回归方程Y=8.42+0.41X1+0.23X2－0.37X3－0.39X1X2－0.045X1X3－0.45X2X3－1.55X12－对回归模型进行方差分析结果见表3。由表3可知，回归模型p＜0.0001，表示该模型高度显著，可以用来进行响应值预测，而模型失拟项不显著，证明该模型选择合适。校正决定系数0.9614，表示该模型能解释96.14%的响应值变化，相关系数R2=0.9831，说明该模型的拟合度良好，表明该模型是可行的，可以用来预测紫玉米多糖的得率。

表2 响应面设计方案与实验结果Table 2 Response surface design and results

表3 回归模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

因素X1(pH)对紫玉米多糖得率的影响的线性效应p＜0.01，是极显著的，X3(酶解时间)产生的影响是显著的，而X2(酶解温度)不显著。X1X2、X2X3对多糖得率的交互影响是显著的，而X1X3不显著，但的曲面效应都极显著。说明各个因素与响应值之间没有表现出简单的线性关系。可以由单因素F值的大小判断各因素对多糖得率的影响顺序。由此得出对多糖得率影响强弱的顺序为pH＞酶解时间＞酶解温度。

2.3.2 双因素间的交互作用的分析由表3可知:本实验所建立的数学回归模型中，在α=0.05水平上，X1与X2、X2与X3交互作用显著，而X1与X3交互作用不显著。依据实验所取得的数据，作出X1与X2、X2与X3三维空间响应面图，据此可分析和评价双因素交互作用的影响，如图6所示，其中的Y表示多糖得率。由图6可以看出，时间一定时，pH与酶解温度的交互作用比较显著，当酶解时间在零水平上时，即3h时，随着pH与酶解温度的变大，得率显著增加，之后呈下降趋势，坡度较缓;当pH在零水平上时，即为5.5时，酶解温度与酶解时间的交互作用表现显著。响应值随着酶解温度和酶解时间的缓慢增加而增加，当达到最大值之后，多糖的得率反而随着条件的增加而下降。经软件分析酶法提取紫玉米多糖的最佳条件:pH5.62，酶解温度60.10℃，酶解时间2.83h(约170min)，在此条件下，紫玉米多糖得率的理论值为8.47%。综合实际操作，紫玉米多糖最佳提取条件为:pH5.5、酶解温度 60℃、酶解时间170min，最后进行三次验证多糖的实际得率为8.42%，与理论值的贴近度达99.41%。

图6 不同因素交互作用对紫玉米多糖得率的影响Fig.6 Effect of interaction of different factors on polysaccharide content from purple corn

3 结论

实验以紫玉米为原料，从酶组合、pH、酶解温度、酶解时间、酶浓度这五个方面考虑多糖的得率。首先筛选出了分步法是最好的酶组合方法。在单因素实验的基础上，对提取参数采用响应面实验进行分析优化，所得结果为:紫玉米多糖最佳提取条件为pH5.5、酶解温度60℃、酶解时间170min，最后进行三次验证多糖的实际得率为8.42%，与理论值的贴近度达99.41%。由响应曲面和等高线图可知，pH、酶解温度、酶解时间对多糖得率的影响的强弱顺序依次为pH＞酶解时间＞酶解温度。

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