豆豉中鲜味组分的分离与鉴定

彭睆睆，崔 春，赵谋明

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州501641)

豆豉与腐乳、酱油、豆酱并称为我国四大传统发酵豆制品，距今已经有2000多年的历史，以其独特而鲜美的滋味受到消费者的欢迎［1］。长期以来，对于豆豉的研究主要集中在微生物、酶系、工艺和挥发性物质等方面，关于豆豉中呈鲜味组份的研究仍未见系统的报道。大豆发酵食品，如豆酱、酱油等能产生比谷氨酸钠(MSG)更温和的鲜味，经研究证实其来源于原料中蛋白质经米曲霉分泌的蛋白酶、肽酶及谷氨酰胺酶等的作用后生成的氨基酸和肽类［2］。因此，本文利用滋味稀释分析法和感官评价对豆豉的超滤分离组份进行研究，旨在为豆豉滋味的进一步改善提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆豉成品 购于广州、湖南、贵州等地，详细见表1。实验中所采用试剂均为国产分析纯。

表1 豆豉样品名称及产地、原料等基本信息Table 1 The name、place and other basic information of lobster sauce samples

GL－21M高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;752N紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;KDN－2C型定氮仪、KDN－40消化炉 上海纤检仪器有限公司;Waters高效液相色谱仪 美国Waters公司;835－50氨基酸自动分析仪日本岛津公司;0.2μm滤膜 Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的前处理 样品真空冷冻干燥后，研磨成粉末用于分析，样品粉末置于干燥皿中保存。称取约5.000g左右的冻干样品粉末，加入50mL去离子水后，在室温下振荡提取2h后，3000r/min下离心20min，取上清液重新4000r/min离心20min，上清液为样品豆豉水提取液，样液4℃保存备用。

1.2.2 基本指标测定 氯化钠按GB/T 12457规定的方法测定;总氮按GB/T 5009.5规定的方法测定;氨基酸态氮按GB/T 5009.39规定的方法测定;总酸的测定均按照GB/T 5009.51规定的方法测定;还原糖测定按照ZB X 66040－1987规定检测。

1.2.3 水溶性氮的测定方法 取2g冻干后的豆豉样品，研磨后加去离子水连续抽提3次，离心取上清液并合并，用凯氏定氮法测定清液含氮量。

1.2.4 感官分析 感官分析评价员根据国标GB/T 14195－1993标准进行筛选和培训，其中女生4名，男生3名(年龄22～30岁)。以谷氨酸钠溶液(鲜味，0.6g/L)、蔗糖溶液(甜味，35g/L)、乳酸(酸味，1.65g/L)、L－异亮氨酸(苦味，5g/L)为标准溶液进行感官评定。将冻干的样品分别配成6%左右的统一水溶性氮含量和盐含量的浓度，在室温(23±2)℃感官评价室进行。感官评定训练及测定过程采用定量描述分析(QDA)方法［3］，并选择使用线性图形标度，采用 0～9分制(无感觉－阈值感觉－微弱－中等－强烈)。最后采用t实验参数统计分析处理数据，以消除评价员使用标度不同部分产生的影响。

表2 四种豆豉的理化指标(%)Table 2 The physical and chemical indicators of four lobster sauces(%)

1.2.5 游离氨基酸含量分析 取10mg冷冻干燥的豆豉样品，加入4mL超纯水和1mL 10%的磺基水杨酸，混匀后放置冰箱中冷藏60min后于10000r/min下离心15min，获得上清液。将上清液调至pH2.2后经0.2μm滤膜过滤。取滤液20μL上835－50氨基酸自动分析仪分析。

1.2.6 豆豉水提物中肽分子量分布的研究 样品的制备:取冻干后的冻干样溶于水，放入离心机中离心，然后再取其上清液过0.22μm过膜进行测定。分析条件:紫外检测波长:280nm;洗脱液:pH7.0的磷酸盐缓冲液;流速:1mL/min;温度:室温;加样量:20μL。

1.2.7 豆豉水提物中呈鲜组分的分离 豆豉水提物分别用截留量为10、3、1ku超滤膜超滤，共分离＞10ku，3～10ku，1～3ku 和 ＜1ku 四种超滤液组分。冷冻干燥后进行感官评定。

1.2.8 统计分析 本文的实验数据分析采用SPSS 15.0软件和Excel 2003软件完成，在检验水平为0.05的条件下进行显著性差异分析。豆豉的感官属性差异采用基于成对数据的t检验法进行，常规指标数据采用方差分析法。

2 结果与讨论

2.1 感官评定结果分析

感官评定结果分析如图1所示。在四类豆豉滋味分布中，苦味、鲜味为其主导滋味，甜、酸味及辣味为其辅助滋味。方差分析结果显示，四种豆豉的鲜味有显著性差异(p＜0.05)，其中鲜味比较突出的是阳江豆豉和贵州水豆豉;天马山和一品香的苦味显著(p＜0.05)强于阳江和贵州水豆豉。四种豆豉的酸、甜味没有显著差异(p＞0.05)。豆豉辣味之间有显著性差异(p＜0.05)，贵州水豆豉的辣味明显强于其他豆豉，这可能是之后添加的辣椒所致;感官评定结果中天马山和一品香的苦味突出，阳江和贵州水豆豉的鲜味突出。

2.2 常规指标测定结果分析

图1 四种豆豉的感官评价结果Fig.1 The sensory evaluation of four lobster sauces

由表2可知，四种豆豉的各项指标都达到了豆豉国家标准中的要求，其中阳江和贵州水豆豉的水溶性氮含量没有显著性差异(p＞0.05)，而四种豆豉之间的总蛋白质、氨基酸态氮、总酸、氯化钠和还原糖在存在显著性差异(p＜0.05)，其中蛋白质含量最高的品种是一品香，最低的品种是贵州水豆豉;氨基酸态氮含量最高的品种是水豆豉，最低的品种是一品香;总酸含量最高的品种是天马山，最低的品种是一品香;含盐量、还原糖和水溶性氮的含量最高的都是阳江，盐份含量最低的品种是天马山，还原糖最低的是水豆豉，水溶性氮含量最低的是一品香。

2.3 豆豉中游离氨基酸组成的分析

大豆发酵过程中，原料中的大分子物质在各种酶的作用下发生一系列的生化反应，分解成低分子化合物，这些物质的相互结合形成了种类繁多的呈味物质，而氨基酸是其中重要的呈味物质。秦礼康［4］研究陈窑豆豉粑中游离氨基酸分布时发现豆豉粑中最丰富的是苦味氨基酸，并且苦味、甜味和鲜味氨基酸明显高于它的滋味阈值。

四种豆豉的游离氨基酸组成及含量百分比如表3所示，其中水豆豉的游离氨基酸的组成与其他三种豆豉有明显区别，这可能是因为其谷氨酸含量高，其他氨基酸相对其含量较低，导致很多游离氨基酸检测不出。图中呈苦味游离氨基酸的含量在其呈味氨基酸中所占的比例最大，天马山、一品香和阳江豆豉的呈苦味的游离氨基酸的百分比分别达到了44.28%、39.98%和40.72%，其次含量比较高的是呈甜味和呈鲜味的游离氨基酸，所占百分比分别为36.39%、23.07%、24.30% 和 9.55%、25.02%、22.53%。虽然苦味游离氨基酸的含量高，但可能由于其它成分如苦味肽、盐和还原糖等综合作用导致三者的苦味有区别。

将每种样品配成图1进行感官评价的6%左右浓度的水溶液时，天马山、一品香和阳江豆豉的各种游离氨基酸含量均没有达到其刺激阈值(谷氨酸)，例如阳江的呈鲜味的谷氨酸是15.96mg/g，配成6%的浓度其值为0.96mg/mL，远小于刺激阈值5mg/mL;然而贵州水豆豉的谷氨酸含量测得为215.46mg/g，配成6%浓度其值为 12.93mg/mL，远高出了其刺激阈值5mg/mL［5］，明显高于其他种类豆豉中谷氨酸含量，这表明贵州水豆豉中高含量的谷氨酸可能是其后生产过程中添加的，非自然发酵而成。结合感官评价结果可见，除贵州水豆鼓外，游离氨基酸并非豆豉中呈鲜味的主要成分。

表3 四种豆豉的游离氨基酸组成(mg/g)Table 3 The free amino acid composition of four lobster sauces(mg/g)

2.4 四种豆豉中肽分子质量分布情况的分析

食品中的肽对其味的重要性早为人类认识，现目前的呈味肽分为甜味肽、苦味肽、酸味肽、咸味肽和鲜味肽，美味肽(BMP)最初是由 Yamasaki［6］从牛肉的木瓜蛋白酶消化液中分离出的辛肽，经鉴定其一级结构为 Lys－Gly－Asp－Glu－Ser－Leu－Leu－Ala。因其具有增强牛肉风味的功能，故被称为牛肉味肽、美味提升肽或强化肽［7］。国外报道了化学合成法合成的BMP的一些性质如有很强的鲜味，与食盐、MSG、IMP 和 GMP 有较好的协同作用［6，8］。鲜味肽不影响其它味觉(酸、甜、苦、咸)，且增强其各自的风味特征［9］，因此它们在各种蔬菜、肉、禽、乳类、水产类乃至酒类增味方面都有良好的效果。

四种豆豉中可溶性肽的分子量分布如表4所示。由表4可见，四种豆豉中分子量大于10ku的肽在所有豆豉中的比值都比较小，表明大豆经过发酵过程中的大部分大分子量肽被降解成了小分子肽;其次含量比较低的是分子量在10～5ku和分子量小于1ku的肽段，含量比较高的是分布在5～3ku和3～1ku之间的肽段，并且5～1ku的肽段在四种豆豉中的含量都超过其总含量的一半。Dunkel［10］等报道分子量在1～5ku的美拉德肽能够提升风味，增强鲜味。宋美［11］等也研究得出大豆蛋白酶解液呈鲜组分主要分布在3ku以下。邓勇［12］等研究发现分子量为500～1000u的大豆多肽苦味较强。基于这些呈味肽方面的报道，本文采用超滤法将自然发酵鲜味突出的阳江豆豉的肽段进行分离和感官评价，以进一步明确其不同肽段的鲜味强度。豆豉肽段进行感官评价时保持其可溶性氮含量和盐含量相同，鲜味评价结果见表5。

表4 豆豉样品中不同相对分子质量肽段占总肽量比值(%)Table 4 The different molecular weight peptides ratio of lobster sauce samples(%)

表5 阳江豆豉鲜味的分布Table 5 The umani distribution of Yangjiang lobster sauce

从表5可以看出，呈最强鲜味的是分子量1～3ku的超滤组分，其次是分子量为3～10ku的肽段。分子量1～3ku的超滤组分在0.25g/L的浓度下仍有明显的鲜味，该浓度远低于谷氨酸的刺激阈值(5mg/mL)，并且其肽分子量分布中1～3ku所占比例是四者最少的，这表明阳江豆豉呈鲜味的成分主要分布在1～3ku的肽段中。其中阳江豆豉的1～3ku的肽段在表4中的含量百分比和其他豆豉相比最低，与其鲜味强弱并不成正比，这可能是不同品种豆豉的发酵菌种不同，导致其酶切位点存在差异，致使其鲜味肽段分布存在差异。

3 结论

3.1 感官评价表明市售豆豉中天马山和一品香的苦味突出，阳江和贵州水豆豉的鲜味突出;游离氨基酸分析表明，除贵州水豆豉外，其他三种豆豉在中自然发酵产生的呈鲜味的游离氨基酸都达不到其刺激阈值。

3.2 研究选取天然发酵生成的鲜味较浓的阳江豆豉，经超滤后感官分析后发现，豆豉水提物中呈现组份主要分布在1～3ku的肽段中。

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