多重PCR法检测与分析鱼塘生态系统大肠杆菌的耐药基因与整合子

梁思思，李珺峤，石 磊，吴希阳，*

(1.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510600;2.暨南大学理工学院，广东广州510600)

大肠埃希氏菌(E.coli)俗称大肠杆菌，是埃希氏菌属(Escherichia)的代表菌，是环境中常见的菌［1］。在一定的条件下，某些血清型的大肠杆菌会引起人或者动物患上各种病，如引起禽类的腹膜炎、气囊炎等疾病。随着抗生素和抗菌药物的大量开发，人们不恰当地使用抗菌药物，使得大肠杆菌对抗生素的耐药日趋严重。我国是世界上滥用抗生素最严重的国家，不合理使用抗生素的现象普遍存在，使得大肠杆菌耐药性在巨大用药压力下逐渐增强［2－5］，从耐药低水平到耐药高水平，从单重耐药到交叉多重耐药的发展，这引起医学界和社会的极大关注。细菌间基因的水平转移是细菌多重耐药性形成和广泛传播的重要原因。整合子介导的细菌耐药机制，因能解释耐药基因的高效快速传播而备受研究者关注。研究表明，细菌通过整合子系统，在整合酶作用下，不断从周围环境捕获外来耐药基因，从而使细菌具有耐药性。整合子作为可移动基因元件，可捕获和整合细菌的耐药基因，在细菌耐药性的传播和扩散中起到了至关重要的作用［6－8］。通常以整合酶的存在与否判断细菌内是否存在整合子。目前根据整合子中整合酶基因(intI)的不同，将已经发现的整合子分为六类，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型整合子最常见［9］。在养殖业生产中，抗生素作为饲料添加剂来预防疾病和促进动物生长，这样低剂量长期的使用，导致动物养殖环境中致病性大肠杆菌耐药菌株大量产生，这些耐药菌通过多种途径进行传播，或将其耐药基因通过畜禽产品直接传递给人类致病菌，引起交叉耐药，对人类的健康造成了严重威胁［10－11］。目前对临床分离的大肠杆菌的耐药基因和整合子携带情况分析和研究的报道很多，但国内外对来自整个鱼塘生态系统的大肠杆菌耐药基因和整合子的研究还比较鲜见。本文对165株来自鱼塘生态系统的大肠杆菌携带耐药基因和整合酶基因的情况进行了检测，通过检测整合酶基因的存在与否判断大肠杆菌是否携带有整合子基因，并且分析鱼塘生态系统中耐药基因和整合子的流行状况。

表1 整合酶引物Table 1 Primers of integrase

表2 PCR反应体系Table 2 PCR reaction system

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株来源 165株菌，来自佛山南海某鱼塘生态系统，包括鸭的肠道、鸭周边生活环境的水体、土壤，鱼的肠道、鱼生活环境的水体、土壤。菌株接种，经过生化鉴定，再用大肠埃希菌鉴定引物uspA进行PCR检测，最后确定为大肠杆菌;Mutiplex PCR Assay Kit、100bp marker 宝生物工程(大连)有限公司。

TC－25/H型基因扩增仪 杭州博日科技有限公司;6321ZJ604721型Mastercycler pro梯度PCR仪艾本德(中国)有限公司;凝胶成像仪 SERIALN;电泳仪 JNUYI。

1.2 实验方法

1.2.1 模板制备 参考文献［12］，用煮沸法制备PCR模板DNA。

1.2.2 PCR扩增 根据所需要检测的19种耐药基因序列分别设计具有相同或者相近退火温度的引物，分为三组。19种抗生素耐药基因为:sulI(磺胺)、SHV(β－内酰胺类)、CAT1(氯霉素)、dhfrV(甲氧苄啶)、FloR(氟甲砜霉素)、aadA(氨基糖苷类)、OXA(β－内酰胺类)、TEM(β－内酰胺类)、cmlA(氯霉素)、CITM(氨苄青霉素)、ereA(大环内酯类)、dhfrI(甲氧苄啶)、aac(3)－I(庆大霉素)、aphA－1(氨基苷类)、MOXM、DHAM、EBCM、aac(3)－IV(阿普拉霉素)、FOXM。整合酶引物的设计参考文献［5，13－14］。如表1 所示。

反应总体系如表2所示。整合酶检测反应条件:94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃ 退火0.5min，72℃2min，30个循环，最后 72℃ 延伸 7min。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与讨论

2.1 大肠杆菌耐药基因多重PCR扩增结果

2.1.1 耐药率分析结果 对165株来自鱼塘生态系统的大肠杆菌进行19种耐药基因分析，PCR结果显示，带有一种以上的耐药基因的菌株有151株，阳性率为91.51%。165株大肠杆菌普遍携带氯霉素、β－内酰胺类TEM、氨基苷类aphA－1耐药基因。其中氯霉素类cmlA的阳性率最高，在165株中有105株菌携带氯霉素类 cmlA耐药基因，阳性率为63.64%，其次是β－内酰胺类TEM，有82株菌检出携带β－内酰胺类TEM耐药基因，阳性率为49.70%。氨基糖苷类中以链霉素耐药基因阳性率最高，35.15%(58/165);头孢类药物耐药基因的携带情况表现为对氨苄青霉素的耐药基因携带率高，MOXM和CITM的阳性率分别为29.46%(33/112)，3.03%(5/165)。详细结果如表3所示。

对不同来源的大肠杆菌进行分类别比较，其中TEM(β－内酰胺类)、cmlA(氯霉素)和 aadA(氨基糖苷类链霉素)在鸭肠、鸭水、鸭土、鱼肠、鱼水、鱼土中都有检出。TEM的检出率分别为59.34%、25.00%、40.74%、40.00%、58.33%、20.00%;氯霉素 cmlA 的检出率比较高，分别为 63.74%、100.00%、25.93%、90.00%、83.33%、20.00%;aadA(链霉素)的检出率分别为 43.96%、10.00%、37.04%、50.00%、8.33%、20.00%。在鸭肠中，(氨基苷类)aphA－1携带率高达96.00%;在鸭水中，cmlA(氯霉素)携带率高达100%;在鱼肠和鱼水中dhfrl(甲氧苄啶)携带率均为100%。详细结果如表4所示。

2.1.2 多重耐药水平分析 对大肠杆菌进行多重PCR检测结果显示，本研究选用的大肠杆菌最多带7种耐药基因 (FloR、aadA、TEM、cmlA、aphA－1、MOXM、aac(3)－IV)，带四种以上耐药基因的菌株占46.05%，带2、3、4、5 种耐药基因的菌株分别有 31、35、47、18株，分别占总菌株数 18.79%、21.21%、28.48%、10.91%。在携带多重耐药基因的菌株中，集中在携带2～5种耐药基因。

表3 大肠杆菌19种耐药基因检测结果Table 3 Detection of 19 resistant genes of E.coli

表4 不同来源大肠杆菌耐药基因检出率(%)Table 4 Frequencies of resistant genes of E.coli from different sources(%)

2.2 大肠杆菌整合酶多重PCR扩增结果

选择带有四种耐药基因以上的菌株(74株)的DNA作为模板，用多重PCR法扩增三类整合酶基因，快速筛选出阳性菌株，结果扩增出大小约为565、403bp左右的片段，与阳性对照确认为Ⅰ型整合酶基因和Ⅱ型整合酶基因。74株菌株中，检出Ⅰ整合酶基因阳性菌株的有65株，检出率为87.84%;Ⅱ型整合酶基因阳性菌株有8株，检出率10.81%;1株为阴性。检测中没发现有携带Ⅲ型整合酶基因菌株。结果如图1、表5所示。

不同来源的携带多种耐药基因的大肠杆菌几乎全部都携带有Ⅰ型整合酶基因，携带型Ⅱ整合酶基因的菌株全部来源于鸭肠。如表6所示。

表5 整合酶检测结果Table 5 Test result of integrase genes

3 讨论

3.1 细菌耐药状况越来越严峻，而且耐药率、多重耐药还有逐年上升的趋势。大肠杆菌很容易产生耐药性，从而使抗菌药物药效降低甚至消失。让人担忧的是，大肠杆菌的耐药性呈进行性增长，这对于由于大肠杆菌感染引起的疾病的治疗带来潜在的危机。因此以对大肠杆菌的耐药性调查以及对大肠杆菌耐药机制进行研究具有重要的意义，从而为解决细菌耐药问题提供理论基础和实验基础［15］。目前，大多数的研究者都集中于临床分离的大肠杆菌的耐药性研究，对整个鱼塘生态系统大肠杆菌耐药基因和整合子携带情况的研究还鲜有报道。随着抗生素在养殖业上的广泛使用和环境中耐药菌的增多，我们有必要对来源于养殖业的大肠杆菌耐药基因的携带情况进行检测和研究细菌耐药传播。

表6 不同来源大肠杆菌整合酶基因携带率Table 6 Frequencies of integrase genes of E.coli from different sources

图1 整合酶基因PCR检测结果Fig.1 PCR result of integrase genes

3.2 本实验的165株大肠杆菌来自鱼塘生态系统中的鸭肠、鸭水、鸭土、鱼肠、鱼水、鱼土，对其进行19种耐药基因(Sul1、SHV、CAT1、dhfrV、FloR、aadA、OXA、TEM、cmlA、CITM、ereA、dhfrl、aac(3)－1、FOXM、MOXM、DHAM、EBCM、aac(3)－IV、aphA－1)的多重PCR检测。PCR结果显示，带有一种以上的耐药基因的菌株有151株，阳性率为91.51%。这表明大肠杆菌中普遍带有耐药基因，其中以氯霉素类、β－内酰胺类的耐药基因居多。从多重耐药水平来看，携带2种及2种以上耐药基因的大肠杆菌比率为86.06%。在携带多重耐药基因的菌株中，集中在携带2～5种耐药基因。这些说明大肠杆菌的耐药水平已经不再停留在低水平的耐药水平了，向多重耐药、交叉耐药水平发展。再对带有4种耐药基因以上的菌株进行整合酶基因检测，结果98.65%的菌株携带有Ⅰ型整合酶基因或Ⅱ型整合酶基因，没有检出Ⅲ型整合酶基因。其中Ⅰ型整合子酶基因检出率高达87.84%。可见，在整合子介导的耐药机制中，以Ⅰ型整合子为主。

3.3 Ⅰ类整合子的存在与否明显影响着大肠杆菌的耐药性和多重耐药率、耐药谱，是基因水平监测多重耐药性的重要指标［13－14，16－17］。鱼塘生态系统中的鸭肠，鸭水，鸭土，鱼肠，鱼水，鱼土中都检测出携带有耐药基因和整合子。这说明在这个鱼塘生态系统中，携带耐药基因和整合子的菌株普遍都有分布，而多重耐药大肠杆菌株中整合子基因又普遍存在。因此整合子可能是诱发大肠杆菌多重耐药的重要原因，并且耐药基因通过整合子可移动的特点向周围环境传播，从而使得周围环境的菌株产生多重耐药、交叉耐药。

4 结论

对鱼塘生态系统及其周围环境进行取样检测后发现，周围的环境中的菌株都不同程度地携带有耐药基因和整合子酶基因。其中携带多重耐药基因的菌株中，Ⅰ类整合酶基因的占大多数。耐药基因可能通过整合子的整合作用向周围环境扩散，使得周围环境的菌株出现不同程度地耐药基因增多。

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