甲基苯并唑衍生物与ＨＩＶ－１逆转录酶相互作用的分子模拟研究

胡建平 唐典勇 孙国峰 等

摘要：对ＨＩＶ－１逆转录酶（ＲＴ）与二氟甲基苯并唑甲基嘧啶硫醚（ＤＦＭＭＴ）及甲基苯并唑甲基嘧啶硫醚（ＭＭＴ）两个甲基苯并唑衍生物的复合物进行了分子动力学模拟，从分子整体、结合模式优化和水分子作用３个角度详细分析了甲基苯并唑衍生物与ＨＩＶ－１ ＲＴ相互识别的机制。结果表明，ＤＦＭＭＴ和ＭＭＴ在ＲＴ中的结合位点几乎一致；但ＤＦＭＭＴ与ＲＴ的π－π堆积作用更强。另外，ＲＴ的ＤＦＭＭＴ结合口袋中有３个稳定的水分子存在，而ＭＭＴ结合则没有水分子参与。３个水分子的协同使得ＤＦＭＭＴ与ＲＴ的相互作用强于ＭＭＴ，这可能是双氟促进抑制活性的作用机制之一。

关键词：甲基苯并唑衍生物；ＨＩＶ－１逆转录酶；分子动力学模拟；双氟；抑制活性

中图分类号：R512.91；R978.7 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）15－3358-04

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ＨＩＶ－１ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ

ＨＵ Ｊｉａｎ－ｐｉｎｇ１，ＴANG Ｄｉａｎ－ｙｏｎｇ１，ＳUN Ｇｕｏ－ｆｅｎｇ１，CHENG Ｙｉｎｇ1，CHANG Ｓｈａｎ２

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｅｓｈａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌｅｓｈａｎ ６１４００４， Ｓｉｃｈｕａｎ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４２， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｗｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｆｏｒ ＨＩＶ－１ ＲＴ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ ｄｅｒｅｖａｔｉｖｅｓ， ｄｉｆｌｕｏｒｏ－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ （ＤＦＭＭＴ） ａｎｄ ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ（ＭＭＴ）． Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒ－ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＨＩＶ－１ ＲＴ ａｎｄ ｔｗｏ ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ ｄｅｒｅｖａｔｉｖｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔａｉｌｅｄｌｙ ａｎａｌｙｚｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｏｖｅｒａｌｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｓ ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｋｅｙ ｒｏｌｅ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＤＦＭＭＴ ａｎｄ ＲＴ ｗａｓ ａｌｍｏｓｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ＭＭＴ， ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ π－π ｓｔａｃｋｉｎｇ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＦＭＭＴ ｗｉｔｈ ＲＴ ｗａｓ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ ｏｆ ＭＭＴ． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｔｈｒｅｅ ｓｔａｂｌｙ ｗａｔｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ ｏｆ ＲＴ ｆｏｒ ＤＦＭＭＴ， ｗｈｉｌｅ ｎｏ ｗａｔｅｒ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＲＴ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ＭＭＴ． Ｔｈｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｗａｔｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｍａｄｅ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＤＦＭＭＴ ａｎｄ ＲＴ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ＭＭＴ， ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｂｅ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｄｉｆｌｕｏｒｉｎ ｆａｖｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ； ＨＩＶ－１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ； ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ； ｄｉｆｌｕｏｒｉｎ； ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ

ＨＩＶ－１逆转录酶（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ， ＲＴ）将融入到宿主细胞中的单链病毒ＤＮＡ催化合成双链病毒前ＤＮＡ，是ＨＩＶ生命周期中必不可少的一个步骤，也是抗ＨＩＶ药物的靶点。非核苷类逆转录酶抑制剂（Ｎｏｎ－ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＮＮＲＴＩｓ）能竞争性抑制ＨＩＶ－１ ＲＴ，阻碍病毒前ＤＮＡ的合成，在治疗艾滋病中起着重要的作用［１－４］。二氟甲基苯并唑甲基嘧啶硫醚（Ｄｉｆｌｕｏｒｏ－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ，ＤＦＭＭＴ）（图１Ａ）是一种非常有潜力的ＮＮＲＴＩｓ先导化合物［５］，研究表明，甲基苯并唑官能团对于维持该分子的抑制活性必不可少，而双氟取代对于其维持高活性十分关键，与之相对的的甲基苯并唑甲基嘧啶硫醚（Ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ，ＭＭＴ）（图１Ｂ）的活性则较低［６］。尽管之前有一系列对ＤＦＭＭＴ及ＭＭＴ的改造研究，但是水分子在这些甲基苯并唑衍生物发挥抑制作用时的角色，以及ＤＦＭＭＴ的抑制剂活性远高于ＭＭＴ的原因尚未被阐明，本研究就这些问题进行探讨，为ＮＮＲＴＩｓ的开发提供参考。

１模拟方法

以ＨＩＶ－１ ＲＴ和ＤＦＭＭＴ的复合物晶体结构［５］为参考（ＰＤＢ代码：２ＫＹＮ）搭建分子动力学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ，ＭＤ）模拟所需的体系结构。由于ＲＴ分子Ｂ链与ＤＦＭＭＴ没有相互作用，故截去Ｂ链；又因为Ａ链分子过于狭长，为了节约计算时间，在不影响计算精度的前提下以ＤＦＭＭＴ质心为中心保留２．５ ｎｍ以内的ＲＴ分子结构，保留的Ａ链区域为Ａｓｎ８１－Ｇｌｕ３９６。将截取的Ａ链Ａｓｎ８１－Ｇｌｕ３９６和ＤＦＭＭＴ晶体结构定义为ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ，另外将ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ中的两个氟原子用氢原子替代，得到的体系定义为ＲＴ＿ＭＭＴ。

ＭＤ模拟采用Ａｍｂｅｒ程序［７］和Ａｍｂｅｒ力场［８］，该力场中蛋白的力场参数数据均基于实验值拟合。模拟温度为３００ Ｋ，溶剂采用ＴＩＰ３Ｐ水模型［９］，ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ和ＲＴ＿ＭＭＴ体系在外围加上１．２ ｎｍ的水分子层后，水分子总数均为２２ ３５１个，总原子数为７２ ２９８个。ＭＤ模拟之前，对体系分别进行两次能量优化，首先约束溶质［约束力常数为４．１８×１０３ ｋＪ／（ｍｏｌ·ｎｍ）］，用最陡下降法优化５ ０００步，再用共轭梯度法优化５ ０００步；去约束后再进行５ ０００步最陡下降法优化和５ ０００步共轭梯度法优化，收敛条件为能量梯度小于４．１８×１０－４ ｋＪ／（ｍｏｌ·ｎｍ）。ＭＤ模拟分为两步，先进行４００ ｐｓ的约束溶质分子ＭＤ模拟［约束力常数为４．１８×１０３ ｋＪ／（ｍｏｌ·ｎｍ）］；温度从０ Ｋ逐步升高到３００ Ｋ，接着进行４ ０００ ｐｓ的无约束恒温ＭＤ模拟。用ＶＭＤ实时跟踪模拟过程中的体系构象，采用ＳＨＡＫＥ算法［１０］约束键长，ＭＤ模拟的积分步长为２ ｆｓ，非键相互作用的截断半径设为１．２ ｎｍ，每隔２ ｐｓ采样１次，每个体系的ＭＤ模拟均收集２ ２００个构象。

２结果与分析

２．１体系整体的模拟分析

首先计算体系ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ和ＲＴ＿ＭＭＴ势能随时间的变化，两个体系的势能分别为（－２２０ １１０±６ ５２３） ｋＪ／ｍｏｌ和（－２２０ ０１１±２ ５８６） ｋＪ／ｍｏｌ，波动范围均小于０．５％，可见两个体系在整个模拟过程中平稳可靠。图２给出了ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ和ＲＴ＿ＭＭＴ体系整体Ｃα原子以及ＤＦＭＭＴ和ＭＭＴ小分子的方均根偏差（Ｒｏｏｔ ｍｅａｎ ｓｑｕａｒｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ，ＲＭＳＤ）随时间的变化。从图２（Ａ）可知，ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ和ＲＴ＿ＭＭＴ复合物体系在２．４ ｎｓ后基本达到平衡，RMSD分别为（０．１７９±０．０１２） ｎｍ和（０．２１８±０．０１３） ｎｍ。可见体系ＲＴ＿ＭＭＴ的波动性比ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ稍大，这可能是由于ＤＦＭＭＴ中两个氟原子突变成ＭＭＴ中两个氢原子，结合口袋区电荷环境的变化导致整体运动性更强。分析ＤＦＭＭＴ和ＭＭＴ抑制剂的ＲＭＳＤ发现，ＤＦＭＭＴ的运动性稍强于ＭＭＴ，但两个抑制剂小分子与ＲＴ均结合稳定，运动性都不大，ＲＭＳＤ均维持在０．１２ ｎｍ以下。

方均根涨落（Ｒｏｏｔ ｍｅａｎ ｓｑｕａｒｅ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ， ＲＭＳＦ）可用来反映体系在整个模拟过程中相对于平均结构所发生的构象变化，较大的ＲＭＳＦ说明对应的残基柔性大［１１］。图３给出了体系ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ和ＲＴ＿ＭＭＴ的Ｃα原子的ＲＭＳＦ分布及相关性。从图３Ａ可知，体系ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ和ＲＴ＿ＭＭＴ的ＲＭＳＦ分布非常相近，柔性较大的区域主要分布在Ｔｈｒ１３１－Ｇｌｙ１５５和Ｃｙｓ２８０－Ｇｌｕ３００几个向外伸展开来的ｌｏｏｐ区。为了精细分析两个体系柔性的差别，图３Ｂ给出了两个体系的ＲＭＳＦ的相关性结果，其相关系数达到０．９５，这进一步表明ＲＴ无论与ＭＭＴ还是与ＤＦＭＭＴ结合，蛋白质的运动性没有发生很大改变。

２．２优化后的结合模式

为了分析ＤＦＭＭＴ和ＭＭＴ抑制剂在水溶液中的运动性差别，并分析这种运动性与前者抑制活性更强的相关性。基于图２Ａ信息，获得并叠落了两个体系最后２ ｎｓ的轨迹（２．４～４．４ ｎｓ，共１ ０００个构象）的平均结构。叠落结果表明，ＤＦＭＭＴ和ＭＭＴ吻合较好，分子中心有微弱的平移。为了详细分析两个抑制剂分子在ＲＴ中的结合模式，给出了体系中ＲＴ与ＤＦＭＭＴ及ＭＭＴ距离小于０．４ ｎｍ的接触残基［１２］。ＤＦＭＭＴ有１５个接触残基，具体为Ｐｒｏ９５、Ｌｅｕ１００、 Ｌｙｓ１０１、 Ｌｙｓ１０３、 Ｖａｌ１０６、 Ｖａｌ１７９、 Ｉｌｅ１８０、Ｔｙｒ１８１、 Ｔｙｒ１８８、 Ｖａｌ１８９、 Ｇｌｙ１９０、 Ｔｒｐ２２９、 Ｌｅｕ２３４、Ｈｉｓ２３５和Ｔｙｒ３１８。ＭＭＴ的接触残基也是１５个，与ＤＦＭＭＴ只有一个不同，具体是用Lｅｕ２２７代替了Ｉｌｅ１８０。相似率如此高的接触残基表明，双氟的有无并没有导致这类化合物在ＲＴ中结合位点发生太大变化。值得一提的是，结合图３Ａ的ＲＭＳＦ分析来看，上述接触残基的柔性均较低，这也印证了这些残基参与结合抑制剂小分子，进而表现出较低的柔性。

通过计算ＤＦＭＭＴ及ＭＭＴ与ＲＴ之间的氢键，发现没有任何氢键的存在，这表明，受体—配体之间的识别还有其他的作用维系。ＤＦＭＭＴ和ＭＭＴ有５个相同的含有芳香侧链的接触残基，即Ｐｒｏ９５、Ｔｙｒ１８１、Ｔｙｒ１８８、Ｔｒｐ２２９和Ｔｙｒ３１８，加上ＤＦＭＭＴ和ＭＭＴ均有芳香基团，它们之间应有较强的π－π堆积作用。图４给出了ＤＦＭＭＴ及ＭＭＴ在ＲＴ中的优化后的π－π相互作用情况，分别用ｂｌａｃｋ－ｒｉｂｂｏｎ和ｂｌａｃｋ－ｓｔｉｃｋ模型表示ＲＴ大分子和抑制剂ＤＦＭＭＴ及ＭＭＴ小分子。从图４可知，双氟取代使得芳香接触残基Ｔｙｒ１８８取向有较大的变化，ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ中的π－π堆积作用比ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ稍强，这可能与ＤＦＭＭＴ抑制活性强于ＭＭＴ有一定的关联性。

２．３水的介导作用

为了分析溶剂水是否参与了ＤＦＭＭＴ和ＭＭＴ与ＲＴ之间的识别，以ＤＦＭＭＴ和ＭＭＴ分子质心为中心，分析一定ｃｕｔｏｆｆ半径内的水分子的个数。图５Ａ统计了ＭＭＴ和ＤＦＭＭＴ一定ｃｕｔｏｆｆ范围内水分子个数。从图中可以看出，在ｃｕｔｏｆｆ为０．４ ｎｍ时，ＤＦＭＭＴ周围仅有１个水分子，在０．４５～０．５５ ｎｍ时，新加入了２个水分子。从０．６ ｎｍ之后，ＤＦＭＭＴ体系基本维持着比ＭＭＴ多２～３个水分子的情况。可以推测，两个氟原子有利于口袋水的进入。之前的报道显示，水在甲基苯并唑衍生物与ＲＴ间起着重要的介导作用。此次研究的结果显示，水没有参与ＭＭＴ与ＲＴ的相互识别，这可能是ＭＭＴ抑制活性较弱的主要原因。图５Ｂ给出了前述的３个口袋水与ＲＴ及ＤＦＭＭＴ之间的相互作用和以３个口袋水氧原子为中心，半径０．５ ｎｍ以内的所有残基，以及水分子与其周围的接触残基的距离。

３小结与讨论

基于ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ和ＲＴ＿ＭＭＴ两个复合物的长时间含水ＭＤ模拟轨迹，通过两个体系的ＲＭＳＦ计算值的相关性分析验证了分子模拟的可靠性。长时间ＭＤ优化给出了水溶液中ＲＴ＿ＤＦＭＭＴ及ＲＴ＿ＭＭＴ复合物结构，通过分析两个体系中抑制剂周围的π－π堆积作用发现，ＤＦＭＭＴ周围的π－π堆积作用强于ＭＭＴ。对两个体系中抑制剂口袋中水的分析结果表明，与ＭＭＴ相比，含有双氟的ＤＦＭＭＴ使得口袋亲水性更高，３个水分子的参与使得ＤＦＭＭＴ与ＲＴ的结合能力强于ＭＭＴ，这可能是ＤＦＭＭＴ抑制性比ＭＭＴ强的主要原因。模拟结果对于基于ＲＴ结构甲基苯并唑衍生物抑制剂设计的研究有一定的指导意义。

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