牡丹籽粕的添加对发酵豆酱理化性质的影响

付玮琦　李西西　任佳敏　赵雪如　李佳莹　李风娟

摘要：牡丹籽粕是油用牡丹籽榨油后得到的副产物，富含蛋白质、多糖、黄酮等营养成分。该研究在传统豆酱的制作原料中添加牡丹籽粕，以研究其对豆酱发酵过程中曲料酶活及营养成分的影响。通过单因素实验确定牡丹籽粕的最佳添加比例为黄豆∶籽粕为7∶3，在该条件下制得的成曲中性蛋白酶、淀粉酶和糖化酶最大酶活分别为1 177.85，686.58，1 564.36 U/g；后酵35 d后，所得牡丹籽粕豆酱中还原糖含量为9.66 g/100 g DW，多肽含量为19.53 g/100 g，总黄酮含量为1.93 mg CE/g DW，酱香浓郁、咸鲜适宜，具有良好的感官接受度，为提升牡丹籽粕附加值及开发新型营养型调味品提供了理论指导和技术思路。

关键词：牡丹籽粕；制曲；发酵豆酱；酶活

中图分类号：TS201.2文献标志码：A 文章编号：1000-9973（2024）01-0013-05

Effect of Addition of Peony Seed Meal on Physiochemical Properties of Fermented Soybean Paste

FU Wei-qi， LI Xi-xi， REN Jia-min， ZHAO Xue-ru， LI Jia-ying， LI Feng-juan*

Abstract： Peony seed meal （PSM） is a by-product obtained after oil extraction from peony seeds， which is rich in proteins， polysaccharides， flavonoids and other nutrients. In this study， peony seed meal is added into the raw materials of traditional soybean paste to study its effects on koji enzyme activity and nutrients during soybean paste fermentation. The best addition ratio of peony seed meal determined by single factor experiment is the ratio of soybean to seed meal of 7∶3. The maximum enzyme activities of neutral protease， amylase and glucoamylase in finished koji produced under such conditions are 1 177.85， 686.58， 1 564.36 U/g respectively. After post-fermentation for 35 days， the reducing sugar content of the obtained soybean paste with peony seed meal is 9.66 g/100 g DW， the polypeptide content is 19.53 g/100 g， and the total flavonoid content is 1.93 mg CE/g DW. The product has a strong paste aroma and moderate saltiness and umami， with good sensory acceptability. This study has provided theoretical guidance and technical ideas for increasing the added value of peony seed meal and developing new nutritious condiments.

Key words： peony seed meal; koji making; fermented soybean paste; enzyme activity

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）是雙子叶植物纲、芍药科、芍药属落叶灌木。其种子牡丹籽富含油脂、蛋白质、黄酮、芍药苷等多种活性成分[1]。牡丹籽粕是牡丹籽经压榨浸出工艺榨油后得到的副产物，含有丰富的蛋白质、多糖、维生素、矿物质等物质[2]，具有抗氧化、抗癌等多种益生功效[3]。牡丹籽粕目前多作为替代氮源用于家畜饲料、植物栽培基质的改善[4]，在食品加工中的应用有限[5]，作为食品配料，其潜力还有待进一步开发。

豆酱（soybean paste）是中国传统调味品，一般以黄豆、面粉为原料，在自然条件下发酵而成。在发酵过程中，微生物能够将原料中的大分子物质（蛋白质、多糖）水解为小分子物质，使营养物质更容易吸收，同时给豆酱带来多种理化活性，对人体健康起到促进作用[6]。目前也有研究通过在原料中添加营养价值较高的食品加工副产物，如酱渣[7]、紫苏粕[8]、菜籽粕[9]的方式来生产豆酱，不仅丰富了豆酱产品的风味、滋味和营养组成，而且充分利用了这些副产物中富含的营养物质，提高了其应用价值。

鉴于此，本研究在豆酱制曲原料中添加牡丹籽粕，对制曲过程中的酶活进行跟踪测定，分析了牡丹籽粕的添加对曲料酶活的影响，并考察了后酵过程中理化性质的变化，为饼粕类资源的开发利用及新型发酵豆类调味品的开发提供了理论指导。

1 材料和方法

1.1 材料

牡丹籽粕：低温液压压榨而成，购于山东菏泽谷雨牡丹生物科技有限公司；大豆：潍坊天下粮仓食品有限公司；菌种：米曲霉（Aspergillus oryzae 3.042），天津科技大学发酵与新资源实验室保藏。

1.2 试剂

谷胱甘肽（GSH）、儿茶素（分析纯）：美国Sigma-Aldrich公司；L-酪氨酸（分析纯）、干酪素（生物试剂）、葡萄糖、福林酚、3，5-二硝基水杨酸（DNS）：北京索莱宝科技有限公司。

1.3 主要仪器设备

Model 1680酶标仪 瑞士Tecan公司；FE28-CN pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；IPP Plus 110培养箱 德国Memmert公司；ALPHA 2-4 LD Plus真空冷冻干燥机 德国Christ公司；5810R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；BF51894C-1马弗炉 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 方法

1.4.1 牡丹籽粕基本成分的测定

水分的测定：参照国标GB/T 10358－2008《油料饼粕 水分及挥发物含量的测定》[10]。

灰分的测定：参照国标GB/T 6438－2007《饲料中粗灰分的测定》[11]。

脂肪的测定：参照国标GB 5009.6－2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》[12]。

蛋白质含量的测定：参照国标GB/T 14489.2－2008《粮油检验 植物油料粗蛋白质的测定》（转换系数6.25）[13]。

1.4.2 豆酱样品的制备

牡丹籽粕粉碎后过80目筛，在60 ℃下干燥15 min；脱壳黄豆按照1∶3的固液比加水，浸泡12 h[14]，沥干水分备用；将面粉、黄豆、牡丹籽粕粉一起放入灭菌锅中，121 ℃，100 kPa，蒸煮20 min[15]。

待原料降温到30～40 ℃之间后，将不同比例的黄豆和籽粕（黄豆∶籽粕为0∶10、3∶7、5∶5、7∶3、10∶0）与固定质量的面粉进行混合，使面粉、籽粕粉均匀地裹在黄豆表面。配制孢子浓度为106～107 spores/mL的米曲霉菌悬液，按照每100 g加入1 mL的比例添加到拌好的黄豆中。将笼屉盖好盖子，放入30 ℃恒温培养箱中培养72 h。期间适时进行翻曲并取样。通过比较曲料酶活確定最终原料配比。

按照最佳原料比例进行制曲并设置对照组（纯黄豆制曲发酵），收曲后将酱曲分装到150 mL玻璃瓶中，每个瓶中装入60 g酱曲，按照1∶1的比例向每个瓶中添加浓度为20%的盐水，放入40 ℃培养箱中进行后酵，于第0，1，3，5，7，14，21，28，35天取样，将样品储藏于－20 ℃备用。

1.4.3 pH值的测定

称取研磨好的样品3.00 g加入烧杯中，再加入20 mL蒸馏水，充分振荡摇匀后测定pH值。

1.4.4 粗酶液的提取

参照李秀婷等[16]的方法提取样品粗酶液，精确称取5.00 g充分研磨的样品加入100 mL蒸馏水，在40 ℃下水浴浸提1 h，间歇搅拌，过滤即为粗酶液，用于样品酶活的测定。

1.4.5 中性蛋白酶活力的测定

中性蛋白酶酶活的测定参照刘文奎[17]的方法并作适当修改。中性蛋白酶酶活的定义为在40 ℃、一定pH下，1 mL稀释后的样品酶液每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸为一个酶活力单位（U/g）。

1.4.6 淀粉酶活力的测定

淀粉酶酶活的测定参照刘婉璐[18]的方法。淀粉酶酶活的定义为1 g样品在一定条件下，1 h水解可溶性淀粉产生1 μmol麦芽糖为一个酶活力单位（U/g）。

1.4.7 糖化酶活力的测定

采用DNS法测定糖化酶酶活[19]。糖化酶酶活的定义为1 g样品在一定条件下（pH 4.6，40 ℃），1 h水解可溶性淀粉产生1 mg葡萄糖为一个酶活力单位（U/g）。

1.4.8 还原糖含量的测定

对1.4.7中糖化酶活力的测定方法进行适当修改即制曲过程中还原糖含量的测定方法，结果以样品干重（g/100 g DW）表示。

1.4.9 水提物的制备

将样品进行真空冷冻干燥处理，用超微粉碎机粉碎后于－20 ℃储存。称取样品冻干粉1 g，加入10 mL蒸馏水，充分涡旋混匀后超声处理15 min，置于水浴锅中沸水浴10 min，在室温下6 000 r/min离心10 min后，过0.45 μm滤膜，得到的滤液即为样品水提物，将水提物浓度标记为100 mg/mL。

1.4.10 多肽含量的测定

多肽含量的测定参照刘婉璐[18]的方法。取15 μL样品水提物、300 μL OPA试剂（1.25 mL 5%溶于甲醇的邻苯二甲醛溶液、25 mL 0.1 mol/L四硼酸钠溶液、2.5 mL 20%十二烷基硫酸钠、0.25 mL β-巯基乙醇混匀后用蒸馏水定容至50 mL）加入96孔酶标板中，涡旋混匀，在室温下反应10 min后用酶标仪在340 nm处测定吸光度。以GSH为标准品，结果表示为g/100 g。

1.4.11 总黄酮含量的测定

后酵过程中总黄酮的测定采用氯化铝比色法[20]。以儿茶素为标准品，将总黄酮含量表示为儿茶素当量（mg CE/g DW）。

1.4.12 感官评价

参照国标GB/T 24399－2009[21]设置感官评分表对样品进行感官评价。感官评价标准见表1。

1.4.13 数据分析

所有实验均设置3个平行（n=3），结果以平均值±标准差表示，使用IBM SPSS Statistics软件（版本26）进行统计学分析，使用OriginPro 2023软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 牡丹籽粕基本成分

牡丹籽粕基本成分见表2。牡丹籽粕中含有的丰富蛋白质可以为微生物的生长提供充足的氮源。同时，脂肪和灰分等营养物质也能够有效改善豆酱的营养组成。

2.2 制曲过程中酶活的动态监测

2.2.1 中性蛋白酶酶活的变化

制曲过程中不同原料比例对中性蛋白酶酶活的影响见图1。

由图1可知，随着牡丹籽粕在原料中添加比例的减小，中性蛋白酶酶活整体上呈现升高的趋势，其中黄豆和籽粕的比例为7∶3的样品在48 h达到最大酶活，为1 177.85 U/g，接近纯黄豆制得的曲料。

2.2.2 淀粉酶酶活的变化

制曲过程中不同原料比例对淀粉酶酶活的影响见图2。

由图2可知，随着发酵的进行，制曲过程中各样品淀粉酶活力呈现上升趋势，其中黄豆和籽粕的比例为7∶3的样品在72 h达到最大酶活，为686.58 U/g。

2.2.3 糖化酶酶活的变化

由图3可知，随着发酵的进行，制曲过程中糖化酶酶活总体上呈现上升的趋势。添加牡丹籽粕的样品都在第72 h达到了最高糖化酶酶活，分别为1 564.36，859.05，906.48，365.85 U/g，其中黄豆和籽粕的比例为7∶3的样品糖化酶酶活最高。

微生物分泌的酶在发酵食品的生产中至关重要，米曲霉酶系种类丰富，蛋白酶能够将原料中的大分子蛋白质水解为小分子的肽和氨基酸，为豆酱带来更高的营养价值和独特的风味[22]。淀粉酶和糖化酶可将原料中的淀粉水解为葡萄糖，为微生物生长提供能量并参与美拉德反应，改善产品的风味和色泽[23-24]。综合以上酱曲中酶活力的变化，选择黄豆和籽粕的比例7∶3为最佳原料比例进行后酵。

2.3 后酵过程中理化性质的动态监测

2.3.1 pH值的变化

在后酵过程中样品pH值的变化见图4。

由图4可知，豆酱在后酵期间，曲霉菌分泌的酶能够将原料中的糖类、蛋白质等物质转化为有机酸、酸性氨基酸等，因此样品的pH值呈现下降趋势。适量的这些物质不仅可以丰富豆酱的口感，而且对豆酱的长期储存有积极作用。

2.3.2 还原糖含量的变化

在后酵过程中样品还原糖含量的变化见圖5。

由图5可知，还原糖含量整体上呈现先升高后缓慢降低的趋势。还原糖含量在后酵前期迅速升高，这是由于微生物分泌的淀粉酶、糖化酶等水解酶对淀粉等大分子物质的水解作用[25]。而随着后酵的进行，还原糖含量有所下降，这是由于淀粉含量下降导致水解生成的还原糖减少，同时其参与了羰氨反应，并作为碳源为微生物的生长提供能量而被进一步消耗。与黄豆酱相比，添加了牡丹籽粕的豆酱整体上还原糖含量更高。

2.3.3 多肽含量的变化

在后酵过程中样品多肽含量的变化见图6。

由图6可知，样品在后酵的前7 d多肽含量增加明显，之后含量基本不再发生明显变化，这与刘婉璐[18]在黄豆酱发酵过程中观察到的趋势相似。多肽是蛋白质的酶解产物，其含量在前期迅速升高与蛋白酶酶活密切相关，而米曲霉在生长过程中会分泌中性蛋白酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶，多种蛋白酶作用使得原料中的蛋白质被大量水解，多肽含量迅速增加。随着后酵过程中pH值的不断降低，中性蛋白酶、碱性蛋白酶酶活受到抑制，多肽含量不再发生明显变化。

2.3.4 总黄酮含量的变化

在后酵过程中样品总黄酮含量的变化见图7。

由图7可知，后酵的前7 d各样品的总黄酮含量变化幅度较小，而在第7～35天，牡丹籽粕发酵豆酱的总黄酮含量总体呈现上升趋势并且最终含量（1.93 mg CE/g DW）高于黄豆样品（0.89 mg CE/g DW）。总黄酮是发酵豆酱中的重要活性物质，研究表明，豆制品发酵过程中大豆苷在微生物的代谢作用下被分解为大豆苷元、黄豆黄素等，这可能是总黄酮含量升高的原因[26]。

2.3.5 感官品质分析

牡丹籽粕豆酱感官评分见图8。

由图8可知，相比于传统酿造黄豆酱，除了滋味和色泽相近外，牡丹籽粕发酵豆酱的酱香风味更加浓郁，且有特殊酯香，整体接受度更好。

3 结论

本研究考察了牡丹籽粕的添加对曲料酶活和发酵过程中豆酱理化性质的影响，以酶活为评价指标，确定豆酱制曲原料中黄豆和籽粕的比例为7∶3，所得曲料具有良好的中性蛋白酶、糖化酶和淀粉酶活力；经后酵，产品中多肽含量与黄豆酱中接近，还原糖和总黄酮含量更高，风味独特，整体接受度高，为开发营养更丰富的新型调味品及牡丹籽粕资源在食品产业中的综合利用提供了借鉴意义。

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收稿日期：2023-07-09

基金项目：天津市自然科学基金项目（16JCYBJC23200）

作者简介：付玮琦（1996-），男，硕士，研究方向：发酵食品功能活性评价。

*通信作者：李风娟（1983-），女，副研究员，博士，研究方向：食品生物活性成分功能性评价。