三次发酵技术提升工业化四川泡青菜风味的研究

张杰　徐飞　赖兴悦　李博　胡刚　赵志峰　董世容　贾银花　潘攀

摘要：目前工业化四川泡青菜大多采用两次发酵工艺结合脱盐、巴氏杀菌生产商品化酸菜的技术，以解决芥菜季节性收获和酸菜常年销售的问题。文章立足于工业化四川泡青菜的加工过程，研究了两次发酵后的半成品泡青菜经过脱盐后的风味损失，并设计了三次发酵进行风味优化。GC-MS与HPLC测定结果表明，脱盐后的泡青菜特征香味物质种类减少，相对含量降低，有机酸含量显著降低。经第3次发酵后，新增了酸类物质，赋予其草本香及酸香，并产生具有发酵果香和花香的己酸乙酯、辛酸乙酯，同时异硫氰酸酯类物质的相对含量降低，泡青菜的特征香味得到提升，自然发酵香味突出；有机酸总量提高12.69%，酸味更加柔和与醇厚；乳酸菌含量从234×102 CFU/g提高到298×103 CFU/g。该研究为工业化泡青菜自然发酵风味的提升提供了数据与工艺参考。

关键词：工业化泡青菜；风味损失；脱盐；增香；有机酸

中图分类号：TS255.54文献标志码：A 文章编号：1000-9973（2024）01-0053-06

Study on Improving Flavor of Industrialized Sichuan Pickled Green Vegetables by Triple Fermentation Technology

ZHANG JieXU FeiLAI Xing-yueLI BoHU GangZHAO Zhi-fengDONG Shi-rongJIA Yin-huaPAN Pan4

Abstract： At present， double fermentation process combined with desalting and pasteurization to produce commercial sauerkraut is mostly adopted in industrialized Sichuan pickled green vegetables in order to solve the problem of seasonal harvest of mustard and perennial sales of sauerkraut. In this paper， based on the processing process of industrialized Sichuan pickled green vegetables， the flavor loss of semi-finished pickled green vegetables by double fermentation after desalting is studied， and triple fermentation is designed to optimize the flavor. The determination results of GC-MS and HPLC show that after desalting， the types and relative content of characteristic aroma substances in pickled green vegetables decrease， and the content of organic acids decreases significantly. After the third fermentation， acids appear， giving them aroma herbaceous and sour aroma， and ethyl caproate and ethyl caprylicate with fermented fruit and flower aroma are produced. At the same time， the relative content of isothiocyanate substances decreases， and the characteristic aroma of pickled green vegetables is enhanced， highlighting the natural fermentation aroma. The total amount of organic acids increases by 12.69%， and the sourness is softer and mellow. The Lactobacillus content increases from 234×102 CFU/g to 298×103 CFU/g. This study has provided data and process references for the enhancement of natural fermentation flavor of industrialized pickled green vegetables.

Key words： industrialized pickled green vegetables; flavor loss; desalination; aroma enhancement; organic acid

泡青菜是四川泡菜中的一种，其独特的酸爽风味来源于芥菜原料、发酵过程微生物的作用以及后期的调味。目前工业化生产的四川泡青菜大多采用两次发酵工艺结合脱盐、巴氏杀菌生产商品化酸菜的技术，两次发酵工艺期间产品的盐含量需达到12%以上[1]，以解決芥菜季节性收获和酸菜常年销售的问题。因此，后续需要通过脱盐处理，降低盐分至6%左右才能继续加工；这些处理在脱去盐分的同时也会使发酵产生的香味、滋味发生改变。加工企业通常采用人工加酸的方式补充泡青菜的酸味，然而此种方式难以补充泡青菜的发酵酸香。为了提升泡青菜的发酵风味，可通过直投式菌种发酵，但是菌种发酵以及低的盐含量会导致发酵进程加快，不能达到与原工艺相同的贮藏期，发酵风味单一，且提升了生产加工的成本。因此，综合考虑以上因素以及泡青菜的加工特点，在特定加工阶段引入三次发酵技术，在不改变原有泡青菜生产工艺的基础上对泡青菜的生产加工过程进行微创新。

成品泡青菜的制备包括前期的腌渍发酵、后期的生产加工过程，目前对泡青菜发酵过程中风味的研究较多[2-3]，而对加工过程导致的风味衰减鲜有报道，且几乎没有对加工过程导致泡青菜风味损失后针对性的调控措施。本文以工业化四川泡青菜为研究对象，采用三次发酵工艺，通过测定香味物质和有机酸指标评价三次发酵后产品的风味属性，并通过乳酸菌数的变化，证明了发酵的进行，验证了工业化的可行性，为高品质泡青菜的生产奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

工业化泡青菜加工过程：原料采收→一次盐渍发酵→翻池二次盐渍发酵→捞出暂存（样品1）→清洗去污→精选整形→清洗脱盐→泡青菜半成品（样品2）。

泡青菜加工过程采样情况：分别采集捞出暂存和泡青菜半成品样品，分别标记为样品1和样品2。

泡青菜三次发酵过程：待加工泡青菜（样品2，即第0天样品）→三次发酵7 d→自然发酵泡青菜。

三次发酵过程采样情况：乳酸菌数和香味物质测定分别采集三次发酵第0天和第7天样品，有机酸测定分别采集三次发酵第0天、第3天、第5天和第7天样品，样品分别标记为0 d、3 d、5 d和7 d。

以上样品均由四川李记酱菜调味品有限公司提供。

1.2 试剂

甲醇（色谱纯）、NaCl、MRS培养基：成都市科龙化工试剂厂；磷酸（色谱纯）：成都市诺尔施科技有限责任公司；草酸SO8180、柠檬酸SC9350、琥珀酸SS9520、DL-苹果酸SM8480、乳酸SL8750（均为标准品）：北京索莱宝科技有限公司；乙酸LCEM501480-FA（标准品）：上海麦克林生化科技有限公司。

1.3 主要仪器与设备

BMS-220 分析天平 上海卓精电子科技有限公司；DZKW-4电子恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司；GCMS-QP2010 SE气相色谱-质谱联用仪 日本Shimadzu公司；DB-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪、TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm） 美国Agilent公司；SPME手动进样装置（包括SPME手动进样手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头（24 Ga，3 pk）） 美国Supelco公司；XK96-A快速混匀器 江苏新康医疗器械有限公司；KH2200B超声波清洗机 昆山禾创超声仪器有限公司；TD25-WS离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 三次发酵风味调控工艺流程

泡青菜半成品→装坛→密封→三次发酵7 d→自然发酵泡青菜。

将水、盐渍老母水、食盐等按一定比例配制成发酵液，调整最终含盐量为6%。将泡青菜半成品装入洗净的泡菜坛中，加入配制好的发酵液，使泡青菜完全浸没在发酵液中，用篾片压紧，加盖，坛口用水密封，冬日10 ℃左右环境下发酵7 d。

1.4.2 香味物质的测定

样品处理：准确称取5.00 g泡青菜样品，切碎后加入样品瓶中，盖好盖后于40 ℃恒温水浴30 min，将已活化好的萃取头插入瓶中，推出纤维头，使之与样品保持1.5 cm的距离，萃取温度40 ℃，萃取时间15 min。待萃取结束后抽回纤维头，拔出萃取头，再将萃取头插入GC进样口，推出纤维头，于250 ℃条件下解吸5 min，抽回纤维头后拔出萃取头，同时启动仪器并采集实验数据。

检测条件：气相色谱（gas chromatography，GC）条件：HP-5MS弹性毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为氦气；不分流进样模式；流速为1 mL/min；进样口温度为240 ℃；升温程序：40 ℃（保持3 min），以5 ℃/min升到130 ℃（保持5 min），以25 ℃/min升到155 ℃（保持0 min），以5 ℃/min升到220 ℃（保持5 min）。质谱（mass spectrometry，MS）条件：离子源温度220 ℃；电子能量70 eV；传输线温度220 ℃；接口温度280 ℃；采集方式：Scan，扫描范围（m/z）：50～550 amu。

定性分析：將所测化合物的质谱信息与数据库中已知化合物的质谱信息进行比对，选择相似度＞85的化合物进行定性分析。

定量分析：根据被测化合物占所有化合物总色谱峰面积的比例，来计算被测组分的相对含量。

1.4.3 有机酸含量的测定

样品处理：称取10 g（精确至0.000 1 g）样品，放入50 mL塑料离心管中，向其中加入20 mL超纯水后在漩涡混合器中混合2 min，经超声10 min后于5 000 r/min离心10 min，取上层清液至50 mL容量瓶中，残留物再加10 mL水重复提取2次，合并上清液于同一容量瓶中，并用0.1%磷酸溶液定容至刻度，混匀，经0.22 μm水相滤膜过滤待测。

检测条件：Agilent TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测器为可变波长扫描紫外检测器（VWD）；流动相A为甲醇；流动相B为0.1%磷酸溶液；检测波长为210 nm；进样量为20 μL；流速为0.6 mL/min；柱温为33 ℃。

定性方法：分别为DL-苹果酸、琥珀酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、草酸6种有机酸标准待测溶液进行分析，以保留时间确定不同的有机酸。分别取泡青菜样品有机酸提取液注入高效液相色谱仪得到相应的高效液相色谱图，与标准品有机酸保留时间进行对比确定样品中所含的有机酸种类。

定量方法：根据有机酸标准曲线对泡青菜样品中所测的有机酸进行定量计算。

1.4.4 乳酸菌数的测定

乳酸菌数的测定参考GB 4789.35—2016。

1.4.5 数据分析

采用Microsoft Excel 2010软件进行数据处理；采用Origin 2018软件进行图片处理。

2 结果与分析

2.1 加工过程对泡青菜风味的影响

2.1.1 加工过程对泡青菜主体香味物质的影响

经加工后泡青菜香味物质变化的总离子流图见图1。相对含量≥1%的主体香味物质的种数、相对含量的变化见表1。样品1、樣品2的主体香味物质种数分别为15种和13种，相对含量分别为94.93%和90.86%。

从主体香味物质组成上分析，样品1、样品2共有的香味物质种类为烃类、醇类、醚类和酯类。烃类物质中共有的主体香味物质为1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）苯、β-倍半水芹烯、（－）-异丁香烯、间异丙基甲苯、α-姜黄烯、姜烯和（+）-2-蒈烯，其中，α-姜黄烯、姜烯和β-倍半水芹烯是姜黄挥发油的主要香味物质，是不饱和烯烃，阈值较低[4—5]，随着加工过程的进行，大体呈现降低趋势。古巴烯为样品2特有的主体香味物质；2-莰烯为样品1特有的主体香味物质。样品1和样品2共有的主体醇类物质为异戊醇，是高级醇类物质，具有酒精味和溶剂味[6]；乙醇为样品1特有的主体香味物质，具有醇香。醚类物质桉叶油醇具有樟脑气息和清凉草药的味道[7]，为共有的主体香味物质。酮类物质姜黄酮和芳姜黄酮为样品2特有的主体香味物质。样品1酯类物质的种类和相对含量最多，分别为异硫氰酸烯丙酯、异硫氰酸丁酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯，除了异硫氰酸烯丙酯为二者共有的主体香味物质外，其他均为样品1特有；异硫氰酸酯类物质是芥菜中硫代葡萄糖苷经代谢转化的风味物质，具有辛辣、刺激和辣根气味[8]；乙酸乙酯具有水果香，乳酸乙酯具有果香、花香[9]。

综上，随着加工的进行，泡青菜的特征发酵风味逐渐减弱，表现为醇类和醚类物质含量减少，β-倍半水芹烯、α-姜黄烯和姜烯含量呈现下降趋势，具有辛辣味的异硫氰酸烯丙酯和异硫氰酸丁酯含量下降，具有发酵特征香气的乙酸乙酯和乳酸乙酯含量也不断下降，而仅有酮类物质种数和相对含量变得丰富。

2.1.2 加工过程对泡青菜有机酸含量的影响

不同加工过程中泡青菜的HPLC图谱见图2。

由表2可知，泡青菜加工过程中样品中共检测出6种有机酸，分别是草酸、DL-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸。其中，样品1中各有机酸的含量分别为草酸9.63 g/kg、DL-苹果酸5.67 g/kg、乳酸9.90 g/kg、乙酸1.26 g/kg、柠檬酸3.57 g/kg、琥珀酸12.83 g/kg，有机酸的总含量为42.86 g/kg；样品2中各有机酸的含量分别为草酸2.29 g/kg、DL-苹果酸0.51 g/kg、乳酸5.96 g/kg、乙酸1.11 g/kg、柠檬酸0.99 g/kg、琥珀酸0.88 g/kg，有机酸的总含量为11.74 g/kg。样品1的有机酸以琥珀酸、乳酸、草酸为主，样品2以草酸、乳酸为主。

整个生产加工过程中，有机酸种类虽然不变，但随着加工过程的进行含量均降低，加工前、后有机酸的总体损失量为72.61%。

2.2 三次发酵对提升泡青菜品质的影响

2.2.1 三次发酵对泡青菜主体香味物质的影响

三次发酵后泡青菜的GC-MS图谱见图3，相对含量≥1%的主体香味物质的种数、相对含量的变化见表3。0 d与7 d泡青菜的主体香味物质种数分别为13种和21种，相对含量分别为90.86%和95.28%。

从主体香味物质组成上分析，0 d样与7 d样共有的香味物质为烃类、醇类、醚类、酮类和酯类。烃类物质中共有的主体香味物质为1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）苯、姜烯、古巴稀、（－）-异丁香烯、（+）-2-蒈烯、α-姜黄烯、β-倍半水芹烯；其中姜烯、α-姜黄烯、β-倍半水芹烯等属于萜烯类化合物，普遍易挥发，阈值低，为姜黄精油常见的香味物质[4-5]，其相对含量均高于0 d样；（－）-异丁香烯具有丁香气味；间异丙基甲苯是0 d样特有的烃类物质；β-红没药烯是7 d样特有的烃类物质。0 d样特有的醇类主体香味物质为异戊醇；7 d样特有的醇类主体香味物质为戊醇、芳樟醇，戊醇属于高级醇，是发酵过程中酵母代谢副产物的主要成分之一，呈水果香，芳樟醇属于不饱和醇，具有花香味。桉叶油醇是0 d样和7 d样共有的醚类主体香味物质；4-烯丙基苯甲醚是7 d样特有的醚类主体香味物质，呈茴香、草香香气[10]。酮类物质包括蒿酮、芳姜黄酮、β-姜黄酮和姜黄酮，其中芳姜黄酮和姜黄酮为0 d样和7 d样共有的主体香味物质，其余为7 d样特有的主体香味物质；蒿酮具有特殊草本气味，芳姜黄酮、β-姜黄酮、姜黄酮是姜黄精油的重要香味物质[11]。酸类物质是7 d样特有的主体香味物质，酸类物质包括乙酸和3-甲基戊酸，乙酸具有酸味[12]。酯类物质中共有的主体香味物质为异硫氰酸酯类物质，其中0 d样的异硫氰酸酯类物质相对含量远高于7 d样；己酸乙酯、辛酸乙酯是7 d样特有的酯类物质，己酸乙酯呈水果香、花香，辛酸乙酯具有水果香[13]。

综上，经三次发酵后，泡青菜的主体香味物质种数和种类增加，新增了酸类物质，0 d样呈现浓郁的辛辣味、姜黄味及淡淡的醇香和花果香，7 d样呈现浓郁的姜黄香、果香及淡淡的草本香、酸香、辛辣味和花香。经三次发酵后，泡青菜的风味更加柔和、丰富。

2.2.2 三次发酵对泡青菜有机酸含量的影响

泡青菜的酸味是反映泡青菜发酵程度的重要指标，其含量的多少与泡青菜的品质密切相关，并非越多越好，需要各种有机酸平衡到一定比例，才可产生柔和的发酵酸香味。现有对泡青菜酸味的评价可以通过感官分析、pH和总酸的测定，以及进一步通过高效液相色谱法鉴定有机酸的种类例如乳酸、乙酸、苹果酸等。前3种方法虽然比较简单，但是较粗略，难以分析酸味物质组成变化。在本次实验中通过对自然发酵7 d的泡青菜总酸和pH值进行测定，发现随着发酵时间的延长，总酸含量在0.88%～0.91%、pH在3.08～3.24之间波动，无明显变化，分析原因可能是总酸和pH值的结果难以反映短时间内三次发酵过程中泡青菜酸类物质变化的真实情况，因此还需通过测定有机酸的种类及含量进行进一步对比。

由图4和表4可知，在整个三次发酵周期内均检测出草酸、DL-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸，并且乳酸是三次发酵泡青菜的主要有机酸种类，其相对含量占到有机酸总量的40%以上。随着发酵时间的延长，有机酸总量增加，发酵7 d后总有机酸含量为13.24 g/kg，相比于三次发酵前增加了12.69%。三次发酵过程中有机酸总量的增加主要源于草酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸含量的增加，其中草酸、柠檬酸、琥珀酸含量的增加幅度较大；草酸具有酸涩味，主要来自泡青菜发酵原料；乳酸本身就是一种很好的调味剂，其酸味柔和浓厚，能够增强人们的食欲；柠檬酸有温和而爽快的酸味；琥珀酸具有类似于贝壳的鲜味，它对盐渍品有助鲜作用[14]。三次发酵过程中有机酸含量的增加与微生物的发酵有关，乳酸菌发酵会产生乳酸和乙酸，同时醋酸菌作用也会产生乙酸，琥珀酸、草酸、柠檬酸和苹果酸的产生与乳杆菌属和片球菌属有关[15]。因此，通过三次发酵后，泡青菜的酸味更加柔和，后味绵长。

2.2.3 三次发酵对泡青菜中乳酸菌数的影响

乳酸菌是泡菜中的主要菌群，泡菜的风味主要来自乳酸菌的发酵，菌种的发酵会产生特定的代谢产物，进而影响终产品的风味。有研究表明，乳酸菌的发酵可以赋予泡菜令人愉悦的风味，例如果味和花香等[15]。由图5可知，经过三次发酵后，泡青菜中乳酸菌数增加，第0天时泡青菜中的乳酸菌数为234×102 CFU/g，第7天时泡青菜中的乳酸菌数为298×103 CFU/g，乳酸菌量提高了一个数量级，这一结果表明是乳酸菌主导了第3次发酵过程中有机酸和香味物质的产生，进一步佐证了第3次发酵过程中产生了自然发酵的愉悦风味。

3 结论

随着泡青菜加工的进行，β-倍半水芹烯、α-姜黄烯、姜烯、异硫氰酸烯丙酯、异硫氰酸丁酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯含量不断下降，泡青菜的特征发酵风味逐渐减弱；此外，泡青菜加工过程中均检测出草酸、DL-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸6种有机酸，但随着加工过程的进行其含量均呈现不断降低的趋势。基于此，引入三次发酵技术，随着发酵的进行，泡青菜主体香味物质表现为种数和种类的增加，整体呈现出浓郁的姜黄香、果香及淡淡的草本香、花香、酸香和辛辣味，风味更加柔和馥郁；有机酸中草酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸含量均增加，酸味更加柔和、醇厚。乳酸菌数明显提升。因此，三次发酵能够有效提升泡青菜的香味和滋味，是风味调控的有效措施。本文为工业化泡青菜自然发酵风味的提升提供了数据与工艺参考。

参考文献：

[1]李洁芝，陈功，张其圣，等.盐渍水再利用处理及其在泡青菜上的应用研究[J].食品与发酵科技，201 50（1）：25-28.

[2]张杰，徐飞，詹军，等.四川泡青菜发酵过程中特征香味物质演变规律研究[J].中国调味品，2022，47（1）：21-25.

[3]余文华，张蜀艳，陈功，等.直投式功能菌对青菜盐渍发酵过程中各指标变化研究[J].食品与发酵科技，2011，47（6）：22-24.

[4]陈磊.泡姜关键挥发性风味物质的鉴定及形成机理研究[D].成都：西華大学，2021.

[5]LIANG H， HE Z， WANG X， et al. Effects of salt concentration on microbial diversity and volatile compounds during suancai fermentation[J].Food Microbiology，2020，91：103537.

[6]孙庆扬，赵悦，杨雪峰，等.“减硫法”酿造对苹果酒中挥发性香气成分的影响[J].中国酿造，2018，37（9）：135-139.

[7]乔明锋，胡金祥，王林，等.基于SPME-GC-MS分析油温对椒麻糊挥发性物质的影响[J].中国调味品，2022，47（7）：182-188.

[8]梅源，刘独臣，赖海梅，等.不同芥菜变种发酵过程中品质因子及硫代葡萄糖苷代谢产物差异分析[J].食品与发酵工业，2023（15）：92-99.

[9]ZHAO Y J， WEI W L， TANG L， et al. Characterization of aroma and bacteria profiles of Sichuan industrial paocai by HS-SPME-GC-O-MS and 16S rRNA amplicon sequencing[J].Food Research International，2021，149：110667.

[10]刘江，朱大军，李洪亮，等.SPME-GC-MS分析火锅中常见6种香辛料挥发性成分物质[J].中国调味品，2022，47（5）：178-182.

[11]徐宗季，何海艳，袁建，等.不同提取方式对比分析姜油中的风味物质[J].食品工业科技，2016，37（21）：304-308.

[12]林泽，覃凤阳，闫鸣霄，等.盐浓度和工业发酵母水对泡青菜风味物质及细菌群落的影响[J].食品科技，2022，47（2）：17-22.

[13]王丽，李雪，刘光宪，等.芦笋猕猴桃复合果酒发酵过程中挥发性香气物质的变化[J].食品工业科技，2022，43（13）：242-250.

[14]THIERRY A， POGACˇIC＇ T， WEBER M， et al. Production of Flavor Compounds by Lactic Acid Bacteria in Fermented Foods[M]//Biotechnology of Lactic Acid Bacteria： Novel Applications， Second Edition，Hoboken：Wiley Blackwell，2015：314-340.

[15]XIAO M Y， HUANG T， XU Y Z， et al. Metatranscriptomics reveals the gene functions and metabolic properties of the major microbial community during Chinese Sichuan Paocai fermentation[J].Food Microbiology，2021，98：103573.

收稿日期：2023-08-03

基金项目：四川省科技成果转移转化示范项目（2022ZHCG0066）；绵阳市2022年中央引导地方科技发展资金项目（220038）

作者简介：张杰（1994—），女，硕士，研究方向：食品加工与安全。

*通信作者：赵志峰（1980—），男，副教授，博士，研究方向：农产品及食品深加工。