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潼川豆豉制曲过程中理化指标变化规律

2019-10-17邵良伟邹强张琼刘达玉

中国调味品 2019年10期
关键词:制曲豆豉蛋白酶

邵良伟,邹强,张琼,刘达玉*

(1.四川轻化工大学 生物工程学院,四川 宜宾 644000; 2.成都大学 药学与生物工程学院,成都 610106)

潼川豆豉是在每年冬季经传统自然制曲发酵的毛霉型豆豉,是四川省三台县久具盛名的传统调味品,至今已有300多年的生产历史。它是利用高蛋白质原料大豆酿造,制成的豆豉具有颗粒松散、色黑俐颗、油润发亮、清香鲜美、滋润化渣、后味回甜等特点[3]。潼川豆豉在我国传统发酵食品中具有较高的地位,至今其仍然采用古老的制作工艺,利用传统自然制曲发酵方法制作,具有明显的地域特色,早在2008年已经被列入第二批国家级非物质文化遗产名录,是我国毛霉型豆豉中的优秀代表。据研究报道,豆豉产品的品质在大程度上由制曲工艺决定[4-6]。在实际生产中,一线工人往往将“倒毛”现象作为辨别豆豉制曲完成与否的重要标准,而“倒毛”在很大程度上仅仅反映豉曲中微生物的生长情况,但是这又与当时的天气状况、温度和湿度等条件息息相关,可谓是靠天吃饭,严重制约了企业的发展。目前对于潼川传统毛霉型豆豉制曲过程中的相关成分的研究报道较少,因此有必要对其制曲过程中的相关成分进行研究,为今后人工控制传统豆豉制曲过程奠定理论基础。

本研究主要对潼川传统毛霉型豆豉制曲过程中环境温湿度、水分、颜色、pH、蛋白酶活力、还原糖、总糖、氨基酸态氮、游离氨基酸等成分进行测定,研究潼川传统毛霉型豆豉在制曲过程中相关指标的变化规律,以期为潼川传统毛霉型豆豉制曲生产工艺优化提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

本实验所用实验原料为四川省三台县潼川农产品开发有限责任公司经自然制曲,取自处于不同制曲时间的潼川毛霉型豆豉。所有豉曲样品均严格密闭后置于-20 ℃冰箱中冷冻待用。

1.2 试剂

L-亮氨酸、L-酪氨酸(均为分析纯):国药集团化学试剂有限公司;干酪素(生物试剂):北京奥博星生物技术有限责任公司;福林试剂(Folin试剂)、三氯乙酸、碳酸钠、葡萄糖、酚酞、硫酸、氢氧化钠、丙三醇、3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)、硫酸钾、硫酸铜、盐酸、无水乙醚、甲醛、硼酸、茚三酮、无水磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钾(均为分析纯):成都市科隆化学品有限公司。

1.3 仪器与设备

电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;CS-220彩谱粉末色差仪 杭州彩谱科技有限公司;UV755B紫外分光光度计 上海佑科仪器仪表公司;F1650高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。

河西学院开展扎实有效的职前专题训练活动,强化学生教学技能培养。援疆实习支教前,学校聘请当地、新疆中小学优秀教师开展专题性质的中学教学法和民族语言、民俗民风等环节的实践培训工作;组织实地走进中小学课堂观摩各学科教学见习活动。通过观模名师课堂、微格教学和小组研讨等形式,要求学生分析教材、撰写教案、教学设计、试讲演练,实行职前训练不过关不达标不准参加实习支教工作的硬性指标。针对师范生专业技能要点,通过职前训练,使学生有备而战,帮助实习支教学生尽快适应岗位角色[11],大大缩短心理准备期和工作适应期,确保实习支教工作的有序开展。

1.4 方法

1.4.1 水分含量的测定

参照GB 5009.3-2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》采用常规的烘箱干燥法。

1.4.2 颜色的测定

将经粉碎的豆豉样品置于标准比色皿中,利用CS-220彩谱粉末色差仪测定颜色,并采用L*、a*、b*颜色系统记录数值。在L*、a*、b*系统中,L*表示亮度,颜色要素a*表示红度,颜色要素b*表示黄度。

1.4.3 pH的测定

称取5.000 g豉曲样品,切碎研磨,加入25 mL蒸馏水,震荡20 min,使用pH计直接测定。

1.4.4 蛋白酶活力的测定

以酪氨酸浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制酪氨酸标准曲线,回归方程为:y=0.0107x-0.0124,相关系数R2=0.9996。参照SB/T 10317-1999中的Folin酚试剂法对样液进行酸性、中性、碱性蛋白酶活力的测定。将在40 ℃下每1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位。

1.4.5 还原糖和总糖含量的测定[7]

以葡萄糖的含量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制葡萄糖标准曲线,回归方程为:y=5.0583x-0.0053,相关系数R2=0.9991。采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定豉曲的还原糖和总糖含量。

1.4.6 氨基酸态氮含量的测定

参照GB 5009.235-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》采用甲醛法测定氨基酸态氮含量。

1.4.7 游离氨基酸总量的测定

以亮氨酸浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制氨基酸标准曲线,回归方程为:y=0.0314x-0.0309,相关系数R2=0.9992。采用茚三酮比色法测定游离氨基酸总量。

1.4.8 数据处理

本研究所有实验数据重复测定3次,数据用Excel进行处理,结果用平均值±标准偏差表示。方差分析采用IBM SPSS Statistics 22.0单因素方差分析和Duncan's多重比较分析,当P<0.05时表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 潼川传统毛霉型豆豉制曲过程中温湿度的变化情况

潼川毛霉型豆豉在自然制曲过程中,外部环境温度和湿度变化将影响制曲时间以及豉曲的质量,进而影响成品豆豉的品质。监测外部环境温度和湿度变化情况,见图1。

图1 潼川传统毛霉型豆豉制曲过程中温湿度的变化情况Fig.1 Changes of temperature and humidity of traditional Tongchuan mucor-type fermented soya beans during the koji-making process

从古至今,潼川人民都是在立冬之时开始制曲,由图1可知,在15 d左右的制曲过程中,温度和湿度分别在17 ℃和82% RH以下,且波动范围不大。之所以选择在这样的条件下制曲,可能是由于在此温湿度环境中有利于制曲微生物毛霉菌的生长。此情况在李幼筠等[8]的研究中也有报道。湿度变化呈现一个先上升后略有降低的趋势,这是由于制曲过程中,外界温度的升高使得豉曲中水分蒸发,这与所测得豉曲中水分含量变化情况一致。而到制曲后期,豉曲中水分蒸发到一定程度,将吸收空气中的水分,以用于微生物的利用,所以湿度会有一定程度的下降。

2.2 制曲过程中豆豉水分、pH、色泽的变化趋势

潼川毛霉型豆豉制曲过程是毛霉菌进行大量生长繁殖的阶段,水分的多少直接影响豆豉制曲过程中微生物的生长和代谢,进而影响各种酶的产生和作用。豉曲颜色的变化在一定程度上反映了豆豉制曲成熟与否。pH值的高低直接影响豉曲中各种酶的活性,尤其是蛋白酶的活性,同时也间接影响微生物的生长和代谢,对豉曲品质有非常大的影响。取不同制曲时间豉曲、测定其水分含量、颜色变化以及pH值,其结果见表1。

表1 制曲过程中豆豉水分、pH、色泽Table 1 Water content, pH and color of fermented soya beans during the koji-making process

注:每列不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

由表1可知,潼川传统毛霉型豆豉自然制曲过程中水分含量呈明显下降的趋势,且在制曲第6~9 d这一时间段内,水分含量降低趋势尤其明显,这是由于此时毛霉菌等微生物极速生长需要大量利用水分,同时在制曲过程中水分也会蒸发一部分。到制曲结束时,豉曲由于水分含量少,此时的豉曲往往比较坚硬。豉曲的亮度L*、红度a*以及黄度b*随着制曲过程的进行,其值均呈现降低趋势,豉曲颜色的变化趋势也反映出在制曲过程中,由于微生物的大量生长,分泌和积累了大量酶系,使体系中产生大量蛋白质水解产物,为后发酵黑色素等的形成提供了充足的底物[9]。在刚开始制曲时,pH值接近中性,但随着制曲进行,pH值一直处于缓慢降低状态。相较于水分和色泽,pH值下降较缓,直至制曲15天时,pH仅降低不到0.5。这主要是制曲微生物毛霉菌的作用,产生大量的酸性和中性蛋白酶,分解蛋白质产生可溶性含氮物质。同时,pH值也反映了潼川传统毛霉型豆豉制曲过程呈现一个酸性发酵过程,有利于酸性和中性蛋白酶等酶系的积累,对豆豉后发酵过程中苦味脱除有显著作用[10]。

2.3 潼川传统毛霉型豆豉制曲过程中蛋白酶活力的变化趋势

图2 潼川传统毛霉型豆豉制曲过程中蛋白酶活力的变化趋势Fig.2 Changes of proteinase activity of traditional Tongchuan mucor-type fermented soya beans during the koji-making process

在豆豉制曲阶段主要是蛋白酶等酶系累积的重要过程,豆豉豉曲质量的好坏与各类酶的活力直接相关[11]。其中蛋白酶活力对于潼川传统毛霉型豆豉后发酵的成品品质尤为重要。

由图2可知,潼川传统毛霉型豆豉在自然制曲过程中,毛霉菌分泌的酶量主要以酸性蛋白酶最多,中性蛋白酶次之,碱性蛋白酶最低。在整个制曲过程中,酸性蛋白酶活力变化趋势明显,到制曲第9天时,活性达到最高,到制曲结束时,又有所降低。中性蛋白酶活力基本趋于稳定,仅有小范围的波动,而碱性蛋白酶活力体现了微弱下降趋势,总蛋白酶活力呈现先升后降的趋势。蛋白酶酶活的高低与制曲过程中的微生物密切相关,潼川传统毛霉型豆豉制曲微生物毛霉主要分泌酸性蛋白酶和中性蛋白酶,而碱性蛋白酶的量十分少。从制曲开始到制曲第9天时,毛霉菌大量生长,产生了大量的蛋白酶,使酶活达到最高。而在制曲后期,随着水分和pH的降低以及豉曲中营养物质的减少,毛霉菌的生长代谢受到抑制,导致蛋白酶活降低。直到制曲结束,即制曲第15天时,毛霉菌大量“倒毛”,蛋白酶活力降到最低。本研究所得结果与房翠兰[12]和杨伊磊等[13]研究的永川豆豉结果存在一定差别,这也反映了不同地域毛霉型豆豉之间存在了明显差别。在今后控制制曲条件时,既要不影响中性和碱性蛋白酶的活力,又要充分发挥酸性蛋白酶的优势,这将有助于缩短制曲时间,达到缩短传统毛霉型豆豉发酵周期的效果。

2.4 潼川传统毛霉型豆豉制曲过程中还原糖和总糖的变化趋势

图3 潼川传统毛霉型豆豉制曲过程中还原糖 和总糖的变化趋势Fig.3 Changes of reducing sugar and total sugar of traditional Tongchuan mucor-type fermented soya beans during the koji-making process

在制曲过程中还原糖作为微生物生长的必需能源直接影响制曲过程中微生物的生长和代谢,同时也反映了微生物在发酵过程中的耗糖情况,对豆豉制曲的质量和成品的品质造成了影响。

由图3可知,潼川传统毛霉型豆豉在自然制曲过程中,总糖含量保持下降趋势,这是由于在制曲过程中,总糖水解的单糖被毛霉菌等微生物利用,且随着制曲时间的增加,微生物所利用的单糖越多,因此总糖含量呈下降趋势。另外,还原糖的含量呈现微弱上升趋势,在制曲前9 d,还原糖含量一直在升高,但之后略有降低,到制曲第15天时,还原糖含量仅降低接近0.5%。由于在制曲过程中,毛霉菌等微生物分泌大量的淀粉酶等,将大豆中的淀粉大量水解,同时制曲过程中也有糖化酶等酶系存在,即使微生物生长需要消耗还原糖,但是还原糖的生成量在多种酶系作用下仍略高于消耗量,所以还原糖含量在制曲过程中呈现缓慢上升趋势。

2.5 潼川传统毛霉型豆豉制曲过程中氨基酸态氮含量的变化趋势

在潼川传统毛霉型豆豉制曲过程中,豉曲氨基酸态氮含量可以反映出蛋白质的水解程度,同时也可以反映出制曲过程中微生物和酶对蛋白质降解能力的大小[14]。

由图4可知,在潼川传统毛霉型豆豉自然制曲过程中,氨基酸态氮含量保持持续增加趋势,在制曲过程中,由于制曲微生物毛霉菌等产生大量的蛋白酶,使得豉曲料中的蛋白质被降解成小分子多肽和氨基酸等可溶性含氮物。故而在制曲前9 d氨基酸态氮含量的增长速率都比较大,但在制曲后期,由于菌丝老化,大部分毛霉菌开始“倒毛”,使得氨基酸态氮的含量增长较为缓慢。此变化趋势与胡鹏等[15]的研究结果变化趋势大体一致。

图4 潼川传统毛霉型豆豉制曲过程中氨基酸 态氮含量的变化趋势Fig.4 Changes of animo acid nitrogen content of traditional Tongchuan mucor-type fermented soya beans during the koji-making process

2.6 潼川传统毛霉型豆豉制曲过程中游离氨基酸总量的变化趋势

潼川豆豉制曲过程中高分子的蛋白质在蛋白酶等酶系的作用下,被水解为低分子的含氮化合物,最终水解为游离氨基酸。游离氨基酸含量可以反映在制曲过程中微生物分泌积累酶系情况的好坏,可用作评价豉曲质量的指标,以及为后发酵风味物质形成奠定基础[16]。

图5 潼川传统毛霉型豆豉制曲过程中 游离氨基酸含量的变化趋势Fig.5 Changes of free amino acid content of traditional Tongchuan mucor-type fermented soya beans during the koji-making process

由图5可知,潼川传统毛霉型豆豉在自然制曲过程中,游离氨基酸含量呈现平稳上升趋势,增加了0.5 g/100 g左右。这是由于在制曲过程中,蛋白酶将豉曲中的蛋白质降解为小分子的氨基酸等可溶性含氮物质。

3 结论

本研究对潼川传统毛霉型豆豉自然制曲过程中环境温湿度、水分、颜色、pH、蛋白酶活力、还原糖、总糖、蛋白质、氨基酸态氮、游离氨基酸等理化指标和主要成分进行了测定。在制曲0~15 d的过程中,豆豉曲样中的水分、pH、总糖含量均呈现不同程度的下降趋势,然而豆豉曲样的颜色变化、还原糖、氨基酸态氮、游离氨基酸含量随着制曲过程的进行呈现上升的趋势。另外,豆豉曲样的蛋白酶活力含量呈先上升后下降的趋势,同时制曲过程中的优势蛋白酶为酸性蛋白酶,其次是中性蛋白酶,最少的是碱性蛋白酶。通过对潼川传统毛霉型豆豉自然制曲过程中理化指标的动态分析,对潼川传统毛霉型豆豉自然制曲过程有了更深入的了解,再结合自然制曲过程中相关的感官特性,为人工控制传统豆豉制曲过程奠定了理论基础,同时也为潼川传统毛霉型豆豉制曲生产工艺优化提供了理论依据。

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