黄酒酒曲中霉菌筛选及其制曲研究

俞剑燊,杨昳津,夏永军,胡 健,方逸群,艾连中*

(1.上海金枫酒业股份有限公司,上海 200120;2.上海理工大学 医疗器械与食品学院,上海 200093;3.上海黄酒工程技术研究中心,上海 200093)



黄酒酒曲中霉菌筛选及其制曲研究

俞剑燊1,3,杨昳津2,3,夏永军2,3,胡 健1,3,方逸群1,3,艾连中2,3*

(1.上海金枫酒业股份有限公司,上海 200120;2.上海理工大学 医疗器械与食品学院,上海 200093;3.上海黄酒工程技术研究中心,上海 200093)

摘要：从上海地区黄酒企业的主发酵液、麸皮、生麦曲和自然块曲中分离出22株霉菌,经透明圈平板初筛和制曲实验复筛,得到3株高产糖化酶、淀粉酶和蛋白酶的曲霉菌株BR84、BR88和BR100。BR84和BR100菌株混合制曲有最高的酶活力,糖化酶、液化酶和蛋白酶活力分别达1099.82、80.65、284.44 U/g。以筛选出的曲霉进行混合制曲并进行黄酒模拟发酵,发现混合制曲发酵黄酒中还原糖和氨氮的生成速率显著高于纯种制曲的。

关键词：黄酒;制曲;霉菌；筛选；混合菌种;酶活力

黄酒是以糯米、小米和玉米等谷物为主要原料,经过蒸煮、糖化、发酵、压榨、过滤、煎酒、陈化等工艺而制成的酿造酒[1]。黄酒含有多种氨基酸、维生素、多肽以及活性多糖等活性成分。“以麦制曲,用曲酿酒”是中国黄酒的特色,麦曲在黄酒酿造中有“酒之骨也”的美称[2]。麦曲质量的优劣直接影响到黄酒的产量和质量,在黄酒发酵中,麦曲具有复合糖化粗酶制剂的功能,并且赋予了黄酒独特的色、香、味。

麦曲分为自然块曲和生麦曲,前者采用自然接种发酵的方式制得,后者是在传统制曲的基础上发展而成,利用熟料接种纯种霉菌进行培养[3]。自然块曲网罗了多种微生物,含有丰富的微生物群落和酶系,酿成的酒口味醇厚,香气较浓,但曲中主要酶类的活性都较低;生麦曲中淀粉酶活性得到了显著提高,但由于菌种单一,酶系简单,酿成的黄酒口味寡淡,杂味较重[4]。霉菌是酒曲中的主要微生物,提供丰富的微生物酶系,主要有:液化酶(也称α-淀粉酶)、糖化酶(也称葡萄糖淀粉酶)和蛋白酶[5]。淀粉酶把淀粉质原料分解为低分子可发酵性糖,为酵母等微生物提供碳源及能量;蛋白酶将原料中的蛋白质分解为肽和氨基酸等营养物质,在为微生物的生长、繁殖提供营养物质的同时,也是黄酒中风味物质形成的前体。

近年来,黄酒企业随着新旧工艺的切换与转变,其在生产上使用的霉菌由于时间过久不断出现退化的现象,因而筛选性能优良的霉菌菌株是黄酒生产中亟需解决的问题。而通过多菌种混合制曲,有望改善黄酒麦曲的品质。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1原料主发酵液、麸皮、生麦曲、自然块曲，由上海金枫酒业股份有限公司提供。

1.1.2培养基YPD琼脂培养基:葡萄糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、琼脂2%，于121 ℃下灭菌20 min,冷却后备用。淀粉酶透明圈培养基:可溶性淀粉5 g/L、NaCl 5 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉10 g/L、琼脂2%，于121 ℃下灭菌20 min,冷却后备用。蛋白酶透明圈培养基:脱脂乳20 g/L、琼脂2%，于121 ℃下灭菌20 min,冷却后备用。

1.1.3主要试剂3,5-二硝基水杨酸、福林酚试剂、可溶性淀粉、三氯乙酸、酪氨酸等,均为分析纯。

1.1.4主要仪器3-18 K型离心机,德国Sigma公司; PB-10普及型pH计,德国Sartorius公司;分光光度计,上海美普达有限公司。

1.2实验方法

1.2.1霉菌分离、纯化与保藏在收集到的样品中加入一定量的无菌生理盐水，进行振荡,制成10倍至106倍的稀释液；然后进行涂布,于28 ℃培养箱中培养2～3 d；挑取可疑单菌落，多次纯化后接入试管斜面上，于4 ℃下保存。

1.2.2平板透明圈法将经分离纯化后的霉菌分别点植于产淀粉酶和蛋白酶的平板上,在可溶性淀粉与脱脂乳粉被霉菌分泌的淀粉酶与蛋白酶分解后,对淀粉酶平板用碘液进行显色,菌落周围产生透明圈,透明圈直径越大,表明菌株具有越强的产淀粉酶或蛋白酶的能力。

1.2.3制曲实验将麸皮与水以1∶1.5的比例进行配料,搅拌均匀后在121 ℃下灭菌20 min；在自然冷却后,以10%的接种量接入由斜面制成的孢子悬浮液,搅拌均匀后置于28 ℃下培养；在培养18～20 h后长出菌丝时进行第一次摇瓶,之后每隔一段时间摇瓶一次；待孢子成熟时,培养结束,全过程需时约72 h。提取粗酶液，测定所制得种曲的糖化酶、液化酶以及酸性蛋白酶的活力。

1.2.4霉菌的分子鉴定根据参考文献[6],提取基因组DNA,并用作PCR扩增的DNA模板。rDNA-ITS序列扩增以及测序所用的引物为ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[8],由上海生工生物工程技术有限公司合成。PCR反应体系(20 μL): ddH2O 13.0 μL,10×Taq Buffer 2.0 μL,上游引物(20 μmol/L) 0.5 μL,下游引物(20 μmol/L)0.5 μL, Mg2+(25 mmol/L)1.5 μL, dNTP(10 mmol/L) 0.5 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/L) 1.0 μL,模板1.0 μL。反应条件为:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共35个循环;72 ℃ 10 min。

1.2.5黄酒的模拟发酵实验称取1000 g糯米，浸泡2 d,蒸熟后置于2 L广口试剂瓶中,加入水700 mL、麦曲100 g、酒母200 mL,拌匀,置于28 ℃培养箱中发酵 4 d，然后再转移至 15 ℃培养箱中继续发酵11 d。在发酵过程中定时取样,将发酵醪液过滤并离心后取上清液进行常规酿造指标的测定。

1.3分析方法

1.3.1糖化酶活力的测定 酶活定义:1 g曲经缓冲液提取后的粗酶液在40 ℃、pH 4.6条件下每分钟分解可溶性淀粉产生1 mg麦芽糖为1个酶活单位,以U/g表示。具体测定方法参照文献[7]。

1.3.2液化酶活力的测定采用钝化法[8]测定。酶活定义同1.3.1。

1.3.3酸性蛋白酶活力的测定采用刘颖等[9]的测定方法。酶活定义:1 g曲经缓冲液提取后的粗酶液在40 ℃条件下麦面中水解产生1 μg酪氨酸为1个酶活单位,以U/g表示。

1.3.4酸度的测定参照中华人民共和国国家标准GB/T 13662─2008,采用NaOH直接滴定法[10]。

1.3.5还原糖的测定以3,5-二硝基水杨酸法[11]测定发酵液中的还原糖浓度。

1.3.6乙醇含量的测定具体参照黄媛媛等[12]的测定方法。

2结果与分析

2.1黄酒酒曲中霉菌的分离筛选结果

从收集到的黄酒酒曲中共分离出22株霉菌,通过产淀粉酶和产蛋白酶的初筛培养基以透明圈法进行初筛,结果如表1所示。由表1可知：有11株具有产淀粉酶能力的菌株和9株具有产蛋白酶能力的菌株；其中有6株既能产淀粉酶也能产蛋白酶的菌株,分别为BR84、BR86、BR88、BR92、BR97和BR100。

2.2单菌株制曲的酶活力比较

对初筛得到的6株菌制曲后,提取粗酶液进行酶活力的测定,结果如图1所示。相较于BR86、BR92和BR97菌株, BR84、BR88和BR100菌株的糖化酶活力高出了100 U/g,表明由这3个菌株制得的曲分解淀粉为低分子可发酵性糖的能力较强。BR97菌株具有最高的酶活力,达到91.13 U/g,比其他5个菌株平均高出20 U/g。BR88具有最高的酸性蛋白酶活力,为290 U/g; BR100菌株次之,为242.22 U/g; BR84和BR86菌株的蛋白酶活力较低,分别为53.89和56.67 U/g; 而BR92和BR97的蛋白酶活力很低，分别仅为2.78和5.56 U/g。

经过蛋白酶、糖化酶、α-淀粉酶活力的综合比较,可知BR84、BR88和BR100三株菌有较为突出的酶活性。其中, BR84具有较高的糖化酶活力,酸性蛋白酶活力一般; BR88具有较强的糖化酶活力和酸性蛋白酶活力,α-淀粉酶活力一般； BR100的糖化酶、α-淀粉酶和蛋白酶活力均较高。为了进一步探究混合菌株的制曲效果,选出BR84、BR88和BR100进行混合制曲。

注：“+”表示透明圈明显；“-”表示没有透明圈。

2.3混合制曲的酶活力比较

对BR84、BR88和BR100进行两两组合混合制曲,酶活力比较结果如图2。可知,混合菌株制曲的蛋白酶和淀粉酶活力较单菌株制曲均有了显著的提高。其中BR100和BR84+BR100两组麦曲具有较为突出的糖化酶活力,分别为1023.87和1099.82 U/g，明显高于BR84、BR88、BR84+88、BR88+BR100的糖化酶活力,为720～890 U/g。BR84+BR100组麦曲具有最高的α-淀粉酶活力,为80.65 U/g；其余5组菌株制曲的α-淀粉酶活力则较为相近。BR84+BR100组麦曲亦具有最高的酸性蛋白酶活力,为284.44 U/g; BR84和BR84+BR88次之,均为201.11 U/g; BR88+BR100组麦曲的酶活力最低,仅为54.4 U/g。

综上所述, BR84+BR100组麦曲具有较为突出的糖化酶、液化酶和蛋白酶活力,故以该组菌株组合制曲后进行黄酒模拟发酵实验,探究组合制曲对黄酒酿造结果(酒度、酸度、还原糖和氨氮含量)的影响。

2.4分子鉴定结果

随着分子生物学技术的发展和广泛应用,核糖体RNA基因的内转录间隔区也被广泛地应用于真菌的分类与鉴定。对筛选结束后得到的BR84、BR88和BR100菌株进行基因组DNA的提取,使用引物ITS1/ITS4对上述3株菌进行扩增,电泳图谱如图3所示。其中BR100菌株的扩增产物浓度较BR84和BR88菌株的高,3株菌的PCR扩增产物片段大小约为600 bp,与ITS目标序列的长度一致。将扩增产物进行测序,利用序列BLAST搜索NCBI核酸数据库,获取与其同源的其它酵母菌株的ITS序列,确定BR84为黄曲霉(Aspergillusflavus), BR88为米曲霉(Aspergillusoryzae), BR100为黄曲霉(Aspergillusflavus)。

2.5黄酒模拟发酵实验结果

在混合制曲与工厂菌株制曲后进行黄酒模拟实验，在发酵过程中的理化指标如表2。由表2可以看出：随着发酵时间的延长,黄酒的酒度、酸度和氨氮含量均逐渐增加,还原糖含量则逐渐降低；在发酵结束后,两组黄酒的酒度并没有显著性差异；还原糖含量在发酵初期迅速降低，尔后表现为缓慢减少。BR84和BR100混合制曲发酵得到的黄酒,其酸度含量在发酵全程中均比工厂菌株高出3%～9%,氨氮含量则高出38%～95%。在发酵1 d后,混合制曲组的还原糖含量为158 g/L,而工厂菌株组为124 g/L,前者比后者高出了27.42%,这主要是由于混合菌株制曲的淀粉酶系活力明显高于工厂菌株制曲的酶系活力。在黄酒酿造过程中呈典型的边糖化边发酵的“双边发酵”,发酵初期是酵母菌生长代谢最为活跃的时期；高糖化力的混合制曲组黄酒在发酵初期酵母菌对底物利用较为充分,因此有较高的酒度、酸度和氨氮含量。

3结语

麦曲是传统黄酒糖化发酵的重要物质基础,也是奠定黄酒风格的重要保障。其中含有丰富的微生物及酶系,对黄酒发酵的质量和黄酒的风味都起到举足轻重的作用。从黄酒的发酵液、麸皮、小麦、生麦曲和自然块曲中分离曲霉等主要糖化菌,通过纯种制曲和混合菌种制曲并测定酶活力，进行筛选后进行了黄酒模拟小试试验。结果表明,混合菌种制曲,既能保持黄酒既有的工艺特色,又能提高原料的利用率,增加营养,可用于黄酒酿造的规模化生产。

参考文献:

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[12] 黄媛媛,肖蒙,彭金龙,等.快速酒精仪在黄酒酒精度分析中的应用[J].中国酿造,2014,33(4):139-141.

(责任编辑:黄荣华)

Studies on Screening of Mycetes from Koji for Chinese Rice Wine and Koji-making

YU Jian-shen1,3, YANG Yi-jin2,3, XIA Yong-jun2,3, HU Jian1,3, FANG Yi-qun1,3, AI Lian-zhong2,3*

(1. Shanghai Jinfeng Wine Limited Company, Shanghai 200120, China; 2. College of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 3. Shanghai Engineering Research Center of Chinese Rice Wine, Shanghai 200093, China)

Abstract：Twenty two strains were isolated from the main fermentation broth, bran, raw wheat koji and natural koji, three strains of mycetes named BR84, BR88 and BR100 which had high activity of amylase and protease were selected by the method of transparent circle and koji-making from Shanghai Jinfeng Wine Limited Company. The enzyme activities of the kojis made by mixed strains were measured and the koji made by BR84 and BR100 strains had the highest enzyme activity, saccharifying enzyme, liquefied and protease enzyme activity were 1099.82, 80.65, 284.44 U/g, respectively. Found that the formation rate of reducing sugar and ammoniacal nitrogen were significantly higher than that of pure starter-making.

Key words：Chinese rice wine; Koji making; Mycete; Screening; Mixed-strains; Enzyme activity

收稿日期：2015-10-27

基金项目：上海市农业科技成果转化资金项目(133919N1000);上海理工大学横向项目(js-010-zx004);上海市研究生创新基金项目(JWCXSL1402)。

作者简介：俞剑燊(1974─),男,江苏无锡人,高级工程师,硕士,从事酿造微生物选育研究工作。*通讯作者：艾连中。

中图分类号：TQ925.7

文献标志码：A

文章编号：1001-8581(2016)05-0079-04