不同炮制工艺苍耳子UPLC 指纹图谱及毒性成分含量比较

黄 成，王学芹，邓 昕，洪 燕，朋汤义*，韩燕全,*，吴德玲

（1.安徽中医药大学第一附属医院/国家中医药管理局中药制剂三级实验室，合肥 230031；2.安徽中医药大学/中药复方安徽省重点实验室/现代药物制剂安徽省工程技术中心，合肥 230031）

苍耳子为菊科植物苍耳Xanthium sibiricum Patr.干燥成熟带总苞的果实，有小毒，具有祛风除湿、通鼻窍和杀虫功效。随着机械化的发展，苍耳子机械去刺的设备和技术日臻成熟，机械去刺的效率高，去刺效果好且能保持果实完整[1]。去刺后的苍耳子，以清炒法炒制时，存在受热不匀、易焦糊和炮制终点难判断等问题，对饮片质量和临床疗效有较明显的影响[2-3]。通过炮制降低苍耳子毒性是保证临床安全用药的关键[4]。本实验采用UPLC 建立苍耳子不同炮制品的指纹图谱并对其主要毒性成分进行含量测定，比较不同方法炮制苍耳子的质量差异，为毒性中药的炮制和临床安全使用提供有益参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters Acquity H-Class 型超高效液相色谱仪，美国Waters 公司；BP211D 型十万分之一电子天平，德国Sartorius 公司；KQ3200DB 型超声清洗器,江苏昆山超声仪器有限公司；YM-902 高精密度防泼水pH 计，姜堰市樱明仪器仪表有限公司；KDC-16H型高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；XFB-200 型高速粉碎机，吉首市中州制药机械厂。

1.2 试剂

绿原酸（14021401）、新绿原酸（11112202）、隐绿原酸（11112203）、3，4-二咖啡酰奎宁酸（12041114）、4，5-二咖啡酰奎宁酸（11081803）、苍术苷二钾盐（14110812）、羧基苍术苷三钾盐（14110813）均购自成都曼斯特化工有限公司；咖啡酸（110885-200102）购自中国食品药品检定研究院；3，5-二咖啡酰奎宁酸（DST 210715-036）购自成都德思特生物技术有限公司；乙腈、甲醇均为色谱纯，购自美国TEDIA公司；水为蒸馏水，购自广州屈臣氏公司。

1.3 药材

生苍耳子药材购自全国各省中药材市场，共15批次，产地和生产日期信息见表1。

表1 苍耳子样品信息

2 指纹图谱建立

2.1 色谱条件

Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸（C），流动相梯度洗脱程序：0 min，3%A；2.5 min，10%A；8 min，15%A；8.5 min，20%A；14 min，25%A；17 min，30%A；20 min，50%A；21 min，3% min；23 min，3%A。体积流量为0.2 mL·min-1，柱温设定为30 ℃，进样体积为1.0 μL，检测波长为327 nm。

2.2 苍耳子不同炮制品制备

生苍耳子：取表1 中各批次苍耳子去除杂质后即为苍耳子生品 （S1～S15）；清炒苍耳子：按照《中国药典》2020 版附录通则（0213）所载清炒法，炒至黄褐色，放凉备用[5]，即为苍耳子清炒品（Q1～Q15）；砂炒苍耳子：按照课题组前期研究，取药材8 倍量的河砂置锅内，中火加热至滑利状态，以距离锅底约1 cm 处温度为砂温，待其稳定至160℃时，投入苍耳子炒制7 min，炒至表面微黄出锅，放凉备用[6]，即为苍耳子砂炒品（SH1～SH15）。取苍耳子各炮制品粉碎机粉碎后过3号筛（50目），备用。

2.3 对照品溶液的制备

分别精密称 取 新绿原酸对照品5.15 mg，绿原酸6.30 mg、隐绿原酸9.42 mg、咖啡酸6.83 mg、3，4-二咖啡酰奎宁酸6.66 mg、3，5-二咖啡酰奎宁酸5.36 mg、4，5-二咖啡酰奎宁酸5.60 mg 置10 mL棕色容量瓶中，以甲醇溶解、定容至刻度，分别配置成7 种对照品贮备液。再分别精密吸取新绿原酸对照品贮备液20 μL、绿原酸2.25 mL、隐绿原酸25 μL、咖啡酸20 μL、3，4-二咖啡酰奎宁酸10 μL、3，5-二咖啡酰奎宁酸100 μL、4，5-二咖啡酰奎宁酸20 μL 至同一10 mL 棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度混匀，得到混合对照品溶液的浓度：新绿原酸1.03 μg·mL-1、绿原酸141.75 μg·mL-1、隐绿原酸2.36 μg·mL-1、咖啡酸1.37 μg·mL-1、3，4-二咖啡酰奎宁酸0.666 μg·mL-1、3，5-二咖啡酰奎宁酸5.36 μg·mL-1、4，5-二咖啡酰奎宁酸1.12 μg·mL-1。

2.4 供试品溶液制备

精密称取“2.2”项3 种炮制品的粉末0.2 g 至10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度并称定质量，于150 W、40 Hz 条件下超声提取40 min，放至室温，用甲醇补足损失重量，摇匀后静置，将沉淀后的上清液于离心机中以12 000 rpm·min-1条件离心10 min，再次静置，临用前用0.22 μm 有机相针式滤器滤过，取续滤液供UPLC 分析用。

2.5 精密度实验

取相同的样品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6 次，记录色谱峰面积和出峰时间，以绿原酸作为参照峰，计算相对峰面积和相对保留时间。结果相对峰面积RSD＜2.00%，相对保留时间RSD＜1.00%，说明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验

取相同的苍耳子炮制品粉末6 份，按照“2.4”项方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下分别进样，以绿原酸作为参照峰，计算相对峰面积和相对保留时间。结果相对峰面积RSD＜2.00%，相对保留时间RSD＜1.00%，说明该方法重复性良好。

2.7 稳定性实验

取同一苍耳子供试液，分别于配置后 0、4、8、12、16、24h 在“2.1”项色谱条件下进样，以绿原酸作为参照峰，计算相对峰面积和相对保留时间。结果相对峰面积RSD＜3.00%，相对保留时间RSD＜1.00%，说明供试品溶液稳定性良好。

3 指纹图谱研究

3.1 相似度评价

分别取各批苍耳子炮制品粉末，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，将所得的指纹图谱以AIA 格式按炮制类别分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，分别以S1（生品1）、Q1（清炒品1）、SH1（砂炒品1）为参照图谱，使用中位数法，时间窗口宽度设为 0.5 min，经自动匹配生成3 个炮制类别各15 批苍耳子炮制品UPLC 指纹图谱共有模式及对照指纹图谱，筛选出共有峰15 个，经与混合对照品图谱比对后，指认出7 个特征峰，其中2 号峰认定为新绿原酸，5 号峰认定为绿原酸，6 号峰认定为隐绿原酸，7号峰认定为咖啡酸，11 号峰认定为3，4-二咖啡酰奎宁酸，12 号峰认定为3，5-二咖啡酰奎宁酸，14 号峰认定为4，5-二咖啡酰奎宁酸，叠加图谱见图1，相似度评价结果见表2。苍耳子不同炮制品的相似度均在0.994 以上，表明苍耳子各炮制品质量均较为稳定。

3.2 聚类分析

将共有峰面积导入 SIMCA-14.1 软件，在标准化处理后进行HCA，得到相应的树状图见图2，当分类距离为120 时，大致可以分为两类，即S11、Q11、SH1～SH15 为一类，S1～S10、S12～S15、Q1～Q10、Q12～Q15 为另一类，说明砂炒品质量较为接近，生品和清炒品质量较为接近。

图2 苍耳子不同炮制品HCA 图

3.3 主成分分析

为能够客观反映苍耳子不同炮制品的差异性，将45 批不同炮制品的共有峰面积导入SPSS 23.0 软件进行标准化处理，提取特征值＞1 的成分做为主成分，结果见表3，主成分因子载荷矩阵见表4。前5 个主成分的累积方差贡献率达到了89.419%，涵盖的信息较为全面。根据绝对值的大小进行判断，4、7、8、9、13、14 号峰对主成分1 的贡献较大，2、6、12 号峰对主成分2 的贡献较大，3、15 号峰对主成分3 的贡献较大，1、10 号峰对主成分4 的贡献较大，13 号峰对主成分5 的功效较大，说明苍耳子用不同方法炮制后质量发生变化，可能是以上多个成分共同作用导致的。使用SIMCA14.1 软件绘制主成分散点得分图，模型的R2X（cum）=0.930，Q2（cum）=0.664，结果见图3，结果显示苍耳子各炮制品分布在横坐标的上下两侧，砂炒品（绿色）分布在上方，生品（红色）和清炒品（蓝色）基本分布在下方。

图3 苍耳子炮制品的 PCA 模型得分散点图

表3 苍耳子不同炮制品主成分特征值及方差贡献率 %

表4 苍耳子不同炮制品主成分因子载荷矩阵

3.4 正交偏最小二乘判别分析

为寻找苍耳子不同炮制品的化学差异成分，将生品、清炒品、砂炒品各15 批指纹图谱数据导入SIMCA 14.1 软件进行有监督模式的OPLS-DA。模型的R2X（cum）=0.569，R2Y（cum）=0.846，Q2（cum）=0.799，均大于0.500，表明模型的拟合度以及预测能力均较为优秀[7-8]，OPLS-DA 得分图见图4。结果表明苍耳子生品和清炒品聚为一类，分布在纵坐标的左侧，砂炒品聚为一类，分布在纵坐标右侧，说明3 种炮制品间的化学成分差异明显，结果与PCA 分析一致。对模型进行置换检验，结果显示R2=（0.000，0.137）、Q2=（0.000，-0.257），表明该模型没有出现过度拟合，可用来判断苍耳子各炮制品的类别[9]。以 VIP＞1 为标准，共得到5个成分，分别为2 号峰（新绿原酸）、6 号峰（隐绿原酸）、11 号峰（3，4-二咖啡酰奎宁酸）、14号峰（4，5-二咖啡酰奎宁酸）、12 号峰（3，5-二咖啡酰奎宁酸），表明这 5 个成分对苍耳子不同炮制品分类有显著影响，也是引起炮制前后化学成分差异的主要成分。

4 苍术苷类含量测定

4.1 色谱条件

Shim-pack C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相为乙腈（A）-磷酸二氢钠（pH=5.6）（B），流动相洗脱程序：0～7 min，10%～20%A；7～10 min，20%～50%A；10～16 min，50%～70%A；16～20 min，70%～10%A；20～22 min，10%～10%A。体积流量为0.8 mL·min-1，柱温设定为30 ℃，进样量为5 μL，检测波长为203 nm，在此条件下，对照品和样品色谱峰能有效分离，结果见图5。

图5 苍耳子中苍术苷类色谱图

4.2 对照品溶液 的制备

分别精密称定羧基苍术苷、苍术苷适量以适量甲醇溶解，配置成羧基苍术苷浓度为33.90 μg·mL-1、苍术苷浓度为25.95 μg·mL-1的混合对照品溶液。

4.3 线性关系考察

取混合对照品溶液 依次稀释，配置成梯度浓度的标准曲线工作液，按照“4.1”项条件进样，以峰面积为纵坐标Y、浓度为横坐标X，进行线性关系考察，羧基苍术苷线性方程为Y=62 180X+790.02，r=0.999 9，线性范围6.78～67.80 μg·mL-1，苍术苷线性方程为Y=17 415X+4 064，r=0.999 7，性范围5.19～51.90 μg·mL-1，r=0.999 8，表明这2 种成分在各自线性范围内线性关系良好。

4.4 精密度实验

取同一供试液，在“4.1”项条件下连续进样6 次，记录峰面积，羧基苍术苷和苍术 苷峰面积的RSD 值分别为0.68%和0.91%，说明仪器精密度良好。

4.5 重复性实验

取同一样品粉末6 份，按“2.4”项分别 制备供试品溶液，在“4.1”项色谱条件下各进样1 次，羧基苍术苷和苍术苷峰面积的RSD 值分别为1.21%和1.42%，证明该法重复性良好。

4.6 稳定性实验

取同一供试液，分别于0、4、8、12、16、24h在“4.1”项色谱条件下进样，羧基苍术苷和苍术苷峰面积的RSD 值分别为1.79%和1.68%，证明供试液稳定性良好。

4.7 加样回收率实验

取同一已知含量的苍耳子样品粉末6 份，精密称定，每份0.1 g，然后加入适量的羧基苍术苷、苍术苷对照品，按“2.4”项制作供试液，按“4.1”项色谱条件进样，计算含量与回收率，结果见表5，说明加样回收率较好。

表5 苍耳子中苍术苷类加样回收率实验

4.8 样品含量

取“2.4”项各供试液，按照“4.1”项条件进样分析，得到羧基苍术苷和苍术苷的色谱峰面积，按照外标法计算2 种成分含量，见表6。结果表明，在与生品比较时，清炒品 羧基苍术苷含量降低（P＞0.05），苍术苷含量升高（P＜0.05）；砂炒品羧基苍术苷含量降低（P＜0.05），苍术苷含量升高（P＜0.05）。

表6 不同炮制苍耳子的羧基苍术苷、苍术苷含量

5 讨论

苍耳子炮制方法一般为清炒后去刺，如《雷公炮制药性解》载：“炒令香，杵去刺用”[10]。以绿原酸、新绿原酸为代表的酚酸类被认为是苍耳子的主要有效成分，具有抗炎、镇痛等生物活性[11-13]；羧基苍术苷类被认为是苍耳子的主要毒性成分，能对机体的多脏器产生毒性[14-16]。本课题组前期对去刺后苍耳子的砂炒工艺进行了研究，从炮制品外观、均一度和炮制时间来看，砂炒法优势更明显，但是其与清炒法炮制的内在质量差别，还需进一步实验研究。HCA、PCA 和OPLS-DA 得出相同的结论，即生品和清炒品为一类，砂炒品为另一类。其原因可能是因为在清炒法炮制过程中，药材温度变化较大，受热不均导致成品间质量差异较大；砂炒法炮制过程中，河砂能在翻炒时包裹药材，使药材温度较为衡定，因此其成品质量较为均一[17-19]。在OPLS-DA 中新绿原酸、隐绿原酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸是5 个贡献较大的成分，多成分共同导致了苍耳子炮制品质量的改变。

羧基苍术苷在炮制后含量降低，高低顺序为生品＞清炒品＞砂炒品；苍术苷在炮制后含量升高，高低顺序为砂炒品＞清炒品＞生品，这一变化有可能是羧基苍术苷在受热时部分转变为苍术苷导致的[20]。

本实验结果表明清炒法和砂炒法均可降低苍耳子毒性成分含量，且砂炒法炮制的苍耳子质量更加稳定均一，可用于炮制苍耳子。