基于LC-MS/MS的咖啡酰奎宁酸异构体鉴别方法研究

李丽丽，马双双，赵恒强，刘 伟，王 晓

(齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东 济南 250014)

咖啡酰奎宁酸类化合物是植物中常见的一类天然酚酸类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤等生物活性，是天然药物发挥药效活性的重要物质基础之一[1-2]。咖啡酰奎宁酸是由奎宁酸和不同数目的咖啡酰基通过酯化反应缩合而成[3]。自然界中的咖啡酰奎宁酸包括单咖啡酰奎宁酸、二咖啡酰奎宁酸、三咖啡酰奎宁酸和多咖啡酰奎宁酸，其中单咖啡酰奎宁酸和二咖啡酰奎宁酸在植物中广泛存在[4]。

图1 单咖啡酰奎宁酸和二咖啡酰奎宁酸的分子结构图Fig.1 Molecule structures of monocaffeoylquinic acids and dicaffeoylquinic acids R represents caffeoyl group(R代表咖啡酰基)

咖啡酰奎宁酸的分析方法包括高效液相色谱法[5-6]、毛细管电泳法[7]、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)[8-9]等。液相色谱-质谱联用法集成了液相色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏度特点，在咖啡酰奎宁酸的分离分析中得到更为广泛的应用。由于咖啡酰基和奎宁酸的酯化位点不同，咖啡酰奎宁酸类化合物存在许多位置异构体[10-11]。如金银花中分离出单咖啡酰奎宁酸类化合物——3-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸和5-O-咖啡酰奎宁酸，以及二咖啡酰奎宁酸类化合物——3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸和4,5-O-二咖啡酰奎宁酸[12]。这些化合物在分子结构上咖啡酰基数目不同或酯化位置不同(图1)，而结构上的差异则会引起药效活性的显著不同。研究发现二咖啡酰奎宁酸类化合物清除DPPH自由基和超氧阴离子的能力高于单咖啡酰奎宁酸类化合物，具有更强的抗氧化活性[13]。4,5-二咖啡酰奎宁酸通过激活瞬时受体电位香草酸受体1(TRPV1)抑制炎症反应，而其它咖啡酰奎宁酸化合物未发现这种作用机制[14]。因此，咖啡酰奎宁酸位置异构体的准确识别对植物功效物质的开发具有重要意义。前期实验发现，咖啡酰奎宁酸的位置异构体在MS/MS分析下具有相同的碎片离子，给其定性带来了困难。不同碰撞能诱导的二级质谱裂解特征可对不同位置异构体进行区分[15-16]。本研究对单咖啡酰奎宁酸和二咖啡酰奎宁酸位置异构体的色谱保留和不同碰撞能下的二级质谱裂解规律进行了系统研究，以实现LC-MS/MS分析下的快速鉴别。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

乙腈、甲醇(色谱级,德国默克公司)，甲酸(色谱级,德国Honeywell Fluka)，3-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸及4,5-O-二咖啡酰奎宁酸标准品购自上海源叶生物科技有限公司;超高效液相色谱仪(ACQUITY,H-Class,美国沃特世)，飞行时间质谱(Q-TOF-MS，Impact Ⅱ,德国布鲁克);超纯水由Millipore Direct-Q 8 UV-R超纯水系统(美国)制备。

1.2 标准品溶液的配制

将标准品3-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸和4,5-O-二咖啡酰奎宁酸用甲醇-水(1∶1，体积比) 溶液溶解，配制成1 mg/mL的母液。

1.3 液相色谱条件

将3-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸和4,5-O-二咖啡酰奎宁酸在不同洗脱梯度下进行分析。色谱柱为Agilent Poroshell 120 SB-Aq C18柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm，美国)，流速为0.4 mL/min，柱温40 ℃。流动相A为含有0.1%甲酸的水溶液，流动相B为纯乙腈溶液，设置不同的洗脱梯度(见表1)。

表1 不同洗脱梯度下的流动相组成Table 1 Composition of mobile phases with different elution gradients

1.4 MS/MS条件

在正离子模式下进行采集。质量数范围为50～1 000，毛细管电压3 500 V，雾化气压力30 kPa,干燥气流速4 L/min，干燥气温度200 ℃，碰撞池碰撞能10 eV，传输时间80 μs，碰撞池射频电压振幅750 Vpp,脉冲前等待时间8 μs,二级碰撞能设置为15～80 eV。

1.5 金银花中咖啡酰奎宁酸的分析

称取金银花100 mg，加入1 mL的甲醇-水(1∶1，体积比)溶液，涡旋5 min。离心10 min，取上清液进行LC-MS/MS分析。色谱柱为Agilent Poroshell 120 SB-Aq C18柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm),流速为0.4 mL/min,柱温为40℃。流动相A为含有0.1%甲酸的水溶液，流动相B为纯乙腈溶液。洗脱梯度设置为：0～5 min，7% B；5～10 min，7%～10% B；10～13 min，10%～25% B；13～16 min，25%～33% B；16～17 min，33%～50% B；17～19 min，50% B；19～19.1 min，50%～5% B；19.1～23 min，5% B。质谱条件设置如下：毛细管电压3 500 V,雾化气压力200 kPa,干燥气流速8 L/min,干燥气温度200 ℃,碰撞池碰撞能7 eV，传输时间60 μs，碰撞池射频电压振幅750 Vpp,脉冲前等待时间5 μs，二级碰撞能设置为15～45 eV。

1.6 数据处理

超高效液相色谱和高分辨质谱采集的数据由Data Analysis 软件(德国布鲁克)进行数据处理。对不同碰撞能下的二级质谱数据，导出谱图中的母离子、子离子以及强度信息。并提取出不同洗脱梯度下单咖啡酰奎宁酸和二咖啡酰奎宁酸的保留时间数据。

2 结果与讨论

2.1 单咖啡酰奎宁酸和二咖啡酰奎宁酸的色谱保留分析

使用Agilent Poroshell 120 SB-Aq C18色谱柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)，在不同的洗脱梯度下，单咖啡酰奎宁酸和二咖啡酰奎宁酸的保留时间见表2。单咖啡酰奎宁酸在C18柱上的保留较弱，洗脱时间在前。而二咖啡酰奎宁酸在C18柱上的保留较强，洗脱时间在后。咖啡酰基的增加减小了咖啡酰奎宁酸的极性，使得其在C18色谱柱的保留增强。洗脱梯度改变，咖啡酰奎宁酸保留时间的绝对值发生变化，但其洗脱顺序未发生改变。单咖啡酰奎宁酸在C18色谱柱的6个不同梯度下的洗脱顺序均为5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、3-O-咖啡酰奎宁酸，而二咖啡酰奎宁酸的洗脱顺序均为3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸和4,5-O-二咖啡酰奎宁酸。该色谱保留特征可为咖啡酰奎宁酸位置异构体的鉴别提供参考。

表2 单咖啡酰奎宁酸和二咖啡酰奎宁酸在不同洗脱梯度下的保留时间Table 2 Retention times of monocaffeoylquinic acids and dicaffeoylquinic acids with different elution gradients t/min

2.2 单咖啡酰奎宁酸的二级质谱分析

3-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸和5-O-咖啡酰奎宁酸是由一个咖啡酸和奎宁酸酯化而成。在低碰撞能下，其二级质谱图(以3-O-咖啡酰奎宁酸为例)中主要信号离子包括母离子377和子离子215、163(图2A、B)；在高碰撞能下，其主要信号离子包括子离子163、145、135、117(图2C)。其中，信号离子163、145、135和117是咖啡酰基的特征子离子。随着碰撞能的增加，母离子377的信号强度逐渐减弱，子离子163的信号强度逐渐增加，成为基峰。在碰撞能25～35 eV时，母离子377和子离子163的强度变化最为显著。考察了3种碰撞能(25、30、35 eV)下377/163强度比值的变化情况，发现随着碰撞能的增加，377/163的强度比值逐渐减小，此比值在单咖啡酰奎宁酸中的大小顺序依次为3-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸和5-O-咖啡酰奎宁酸(图2D)。单咖啡酰奎宁酸的结构区别是奎宁酸和咖啡酸的酯化位置不同，子离子163由酯键发生断裂产生。分析结果说明单咖啡酰奎宁酸中3-O-咖啡酰奎宁酸最难发生裂解，5-O-咖啡酰奎宁酸最易发生裂解，这与其几何结构、空间位阻和结构稳定性有关。

图2 不同碰撞能下,3-O-咖啡酰奎宁酸的二级质谱图(A～C)和单咖啡酰奎宁酸中377/163的强度比值分布图(D)Fig.2 MS/MS spectra of 3-O-caffeoylquinic acid (A-C) and intensity ratios of 377/163(D) at different collision energiesA:25 eV;B:35 eV;C:45 eV

2.3 二咖啡酰奎宁酸的二级质谱分析

3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸和4,5-O-二咖啡酰奎宁酸是由2个咖啡酸和奎宁酸酯化而成。相对于单咖啡酰奎宁酸，在二级质谱分析时，二咖啡酰奎宁酸首先丢失1个咖啡酰基，出现质量数为377的信号峰。二咖啡酰奎宁酸在低碰撞能下(3,5-O-二咖啡酰奎宁酸为例)，主要信号离子包括母离子539和子离子377(图3A、B)，在高碰撞能下，其主要信号离子包括子离子377、215、163、145、135，子离子163成为基峰(图3C)。随着碰撞能的增加，母离子539的信号强度逐渐减弱。子离子377的信号强度在25～35 eV范围内随着碰撞能的增加而显著增强，在35～45 eV范围内则随着碰撞能的增加显著减弱。子离子163在35～45 eV显著增强。在25、30、35 eV碰撞能下，母离子539和子离子377的强度比值(539/377)顺序为4,5-O-二咖啡酰奎宁酸>3,4-O-二咖啡酰奎宁酸>3,5-O-二咖啡酰奎宁酸(图3D)。在35、40、45 eV碰撞能时，子离子377和163的强度比值(377/163)顺序为3,5-O-二咖啡酰奎宁酸>4,5-O-二咖啡酰奎宁酸>3,4-O-二咖啡酰奎宁酸(图3E)。通过二咖啡酰奎宁酸母离子539和子离子377的强度变化趋势，结合单咖啡酰奎宁酸的裂解规律，推测3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸分别首先发生5-位、4-位和5-位的酯键断裂得到子离子377。结果说明由于二咖啡酰奎宁酸中咖啡酰基取代位置不同造成了其空间位阻、结构稳定性的差异，其中，4,5-O-二咖啡酰奎宁酸最难发生裂解，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸最易发生裂解。

图3 不同碰撞能下，3,5-O-二咖啡酰奎宁酸的二级质谱图(A～C),以及二咖啡酰奎宁酸中539/377(D)、377/163(E)的强度比值分布图Fig.3 MS/MS spectra of 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (A-C) and intensity ratios of 539/163(D) and 377/163(E) at different collision energiesA:25 eV;B:35 eV;C:45 eV

2.4 实际应用

图4 金银花中咖啡酰奎宁酸的提取离子流色谱图Fig.4 Extracted ion chromatogram of caffeoylquinic acids in honeysuckle1.5-O-caffeoylquinic acid,2.4-O-caffeoylquinic acid,3.3-O-caffeoylquinic acid,4.3,4-di-O-caffeoylquinic acid,5.3,5-di-O-caffeoylquinic acid,6.4,5-di-O-caffeoylquinic acid

单咖啡酰奎宁酸的二级质谱裂解特征碎片离子为215、163、145、135、117。二咖啡酰奎宁酸的二级质谱裂解特征碎片离子为377、215、163、145、135。在金银花的LC-MS/MS分析中，通过精确质量数和二级质谱特征，基于4.4 min(峰1)，9.1 min(峰2)和9.4 min(峰3)识别出单咖啡酰奎宁酸类成分，基于15.4 min(峰4)、15.7 min(峰5)和16.0 min(峰6)识别出二咖啡酰奎宁酸类成分(图4)。对于单咖啡酰奎宁酸成分，377/163的强度比值在25 eV时依次为峰3(16.1)>峰2(3.4)>峰1(2.5)。对于二咖啡酰奎宁酸成分，539/377的强度比值在25 eV时依次为峰6(4.4)>峰4(3.2)>峰5(1.9)，377/163的强度比值在35 eV时依次为峰5(3.0)>峰6(1.7)>峰4(1.5)。同时参考洗脱顺序，金银花中峰1、峰2和峰3分别鉴别为5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸和3-O-咖啡酰奎宁酸，峰4、峰5和峰6分别鉴别为3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸和4,5-O-二咖啡酰奎宁酸，并通过标样验证。

3 结 论

单咖啡酰奎宁酸和二咖啡酰奎宁酸是植物界中常见的多酚类化合物，由于咖啡酰基与奎宁酸的酯化位置不同，而存在很多位置异构体。本研究对单咖啡酰奎宁酸和二咖啡酰奎宁酸的位置异构体进行了色谱和二级质谱分析。咖啡酰基的增加减小了咖啡酰奎宁酸的极性，使其在C18色谱柱的保留增强。单咖啡酰奎宁酸的特征碎片离子有215、163、145、135、117，可通过母离子377和子离子163的强度比值(377/163)进行区分。二咖啡酰奎宁酸的特征碎片离子有377、215、163、145、135，可通过母离子539、子离子377和163的强度比值(539/377、377/163)进行区分。咖啡酰奎宁酸类化合物的色谱保留和质谱裂解规律的揭示为其位置异构体的快速鉴别提供了方法指导。