阴炎净洗液标准汤剂的HPLC指纹图谱研究*

邱盼子，肖作奇，潘 涛，黄 懿，黄 涛，欧阳波

（湖南省妇幼保健院，湖南 长沙 410008）

阴炎净洗液是湖南省妇幼保健院临床应用二十余年的中医妇科制剂，由黄连、黄柏、苦参、蒲公英、龙胆、连翘、地肤子等9味中药材配伍而成。全方组成结构严谨，黄连、黄柏均具有泻火燥湿、解毒杀虫之功效，二者同用，共清中下焦之湿热，共为方中君药[1-5]；苦参，大苦大寒，退热泄降，荡涤湿火，其燥尤烈，故能杀湿热所生之虫，为方中臣药[6-8]；并佐以其余6味清热燥湿药，具有清热解毒、消炎止痛、杀虫止痒、消肿止痛之功效[9-18]，主要用于霉菌、滴虫及细菌引起的阴道炎、宫颈炎、外阴瘙痒、湿疹及淋病的辅助治疗。

2015年版《中华人民共和国药典》仅采用个别指征性成分的含量来对中药材或中药制剂进行质量控制，但中药是以多成分作为一个整体来发挥药效的，仅对几个成分进行定性或定量控制难以全面评价中药材或中药制剂的质量特征。基于中药整体质量控制观，本研究选用10批阴炎净洗液中药饮片制备阴炎净洗液标准汤剂，采用HPLC-DAD法建立了标准汤剂指纹图谱，并对13种主要成分进行了指认，可为阴炎净洗液的整体质量控制提供参考依据。

1 仪器与材料

Agilent HP 1260型HPLC仪，包括G13222在线脱气机、G1312B二元泵、G1316A柱温箱、G1379B DAD检测器、Agilent Open Lab化学工作站（美国Agilent公司）；TDZ4低速台式离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。对照品信息见表1 。

表1 对照品信息

甲醇、乙腈（色谱纯，美国Tedia公司）；磷酸、磷酸二氢钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。所有中药饮片均购自湖南省衡东县中药饮片厂，由湖南省妇幼保健院药学制剂部潘涛副主任中药师鉴定为正品。10批次中药饮片批号见表2。

表2 10 批次中药饮片批号

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：ACE EXCEL C18-AR色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈（B）：10 mmol/L磷酸二氢钠水溶液（A），流速：1.0 mL/min，柱温：35 ℃，检测波长：215 nm，进样量：10 μL。流动相梯度为：0～8 min：95%A；8～20 min：95～84%A；26～30 min：84%～70%A；30～45 min：70%A；45～50 min：70%～15%A；50～55 min：15%A；57～60 min：95%A。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的配制 分别取苦参碱、氧化苦参碱、咖啡酸、龙胆苦苷、盐酸黄柏碱、连翘酯苷A、表小檗碱、连翘苷、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、地肤子皂苷Ic和蛇床子素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含213.2、234.0、143.4、201.6、212.6、205.6、211.0、209.2、212.2、203.8、206.6、2 086.0、46.3 μg的溶液，即得。分别取适量苦参碱、氧化苦参碱、咖啡酸、龙胆苦苷、盐酸黄柏碱、连翘酯苷A、表小檗碱、连翘苷、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、地肤子皂苷Ic和蛇床子素于容量瓶中，用甲醇定容，过0.22 μm有机系滤膜，制得含有13种成分的混合对照品溶液。

2.2.2 标准汤剂供试品溶液的制备 按照处方量（共364 g）精密称取药材置不锈钢锅中，参考《湖南省医疗机构制剂规范》，加2 944 mL（8倍）水浸泡30 min，武火煮沸后转为文火煎煮45 min，滤过得药液；残余药渣再加2 184 mL（6倍）水煎煮45 min，使用布氏漏斗过滤，合并2次滤液，减压浓缩（60 ℃），转移至1 000 mL容量瓶中，用纯净水定容至1 000 mL，得标准汤剂。精密吸取标准汤剂1 mL置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，经0.22 μm有机系微孔滤膜滤过，得标准汤剂供试品溶液。

2.2.3 单味药材溶液的制备 按照处方量分别称取阴炎净洗液单味药材，按“2.2.2”项下样品制备方法制备各单味药材溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下同一批标准汤剂供试品溶液10 μL，重复进样测定6次，记录色谱图，选择连翘酯苷A峰（30号峰）作为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间RSD均小于0.9%，相对峰面积RSD均小于1.6%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 精密吸取“2.2.2”项下同一批标准汤剂供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h以“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，选择连翘酯苷A峰（30号峰）作为参照峰，计算得各共有峰的相对保留时间RSD均小于1.5%，相对峰面积RSD均小于2.1%，表明标准汤剂供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.3 重复性试验 按“2.2.2”项下方法制得标准汤剂供试品溶液6份，以“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，选择连翘酯苷A峰（30号峰）作为参照峰，计算得各共有峰的相对保留时间RSD均小于1.3%，相对峰面积RSD均小于2.7%，表明方法重复性良好。

2.4 指纹图谱研究

2.4.1 参照峰的选择 在标准汤剂供试品溶液色谱峰中，连翘酯苷A峰（30号峰）峰面积最大，保留时间适中，分离度好，故选为参照峰。

2.4.2 指纹图谱的建立 按“2.2.2”项下阴炎净洗液标准汤剂制备方法制备10个不同批次的阴炎净洗液标准汤剂供试品溶液，按照“2.1”项下方法进样分析。应用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”进行多点校正，然后匹配生成对照指纹图谱（见图1），确定有53个共有峰，10批阴炎净洗液标准汤剂与对照指纹图谱比较相似度均大于0.950（见表3），表明不同批次中药饮片的化学成分及标准汤剂的制备方法比较稳定。

图1 10 批次阴炎净洗液标准汤剂叠加指纹图谱及对照指纹图谱

表3 10 批次阴炎净洗液标准汤剂指纹图谱相似度数据

2.4.3 色谱峰归属分析 结合阴炎净洗液标准汤剂和各单味药材供试品溶液的色谱图进行分析，发现4、5、10、11、14、28、29、30、35、36、45、46、47、48、49号峰来源于苦参；2、8、15、18、24、25、29、34、36、41、44、46、47、52 号峰来源于蒲公英；17、19、29、31、32、33、46、47号峰来源于龙胆；2、6、7、12、13、14、17、20、21、23、25、26、27、29、30、32、33、34、36、42、44、46、47、48号峰来源于黄柏；2、6、12、26、28、29、30、33、35、36、38、40、43、51、52号峰来源于连翘；3、4、9、16、17、22、23、27、28、30、33、35、38、39、41、42、44、47、51、52号峰来源于黄连；47、48、50号峰来源于地肤子；47、48、52、53号峰来源于蛇床子；1、9、14、15、16、17、20、32、33、34、37、47、49号峰来源于百部。其中2号峰为蒲公英、黄柏、连翘共有；4号峰为苦参、黄连共有；6号峰为黄柏、连翘共有；9号峰为黄连、百部共有；12号峰为黄柏、连翘共有；14号峰为苦参、黄柏、百部共有；16号峰为黄连、百部共有；17号峰为龙胆、黄柏、黄连、百部共有；20号峰为黄柏、百部共有；23号峰为黄连、黄柏共有；25号峰为蒲公英、黄柏共有；26号峰为黄柏、连翘共有；27号峰为黄柏、黄连共有；28号峰为苦参、连翘、黄连共有；29号峰为苦参、蒲公英、龙胆、黄柏、连翘共有；30号峰为苦参、黄柏、连翘、黄连共有；32号峰为龙胆、黄柏、百部；33号峰为龙胆、黄柏、连翘、黄连、百部共有；34号峰为蒲公英、黄柏、百部共有；35号峰为苦参、连翘、黄连共有；36号峰为苦参、蒲公英、黄柏、连翘共有；38号峰为连翘、黄连共有峰；41号峰为蒲公英、黄连共有；42号峰为黄柏、黄连共有；44号峰为蒲公英、黄柏、黄连共有；46号峰为苦参、蒲公英、龙胆、黄柏共有；47号峰为苦参、蒲公英、龙胆、黄柏、黄连、地肤子、蛇床子、百部共有；48号峰为苦参、黄柏、地肤子、蛇床子共有；49号峰为苦参、百部共有；51号峰为连翘、黄连共有；52号峰为蒲公英、连翘、黄连、蛇床子共有。通过与混合对照品溶液比对分析，可确定其中13种成分：5号峰为苦参碱、10号峰为氧化苦参碱、18号峰为咖啡酸、19号峰为龙胆苦苷、23号峰为黄柏碱、30号峰为连翘酯苷A、39号峰为表小檗碱、40号峰为连翘苷、41号峰为黄连碱、42号峰为巴马汀、44号峰为小檗碱、50号峰为地肤子皂苷Ic、53号峰为蛇床子素。混合对照品溶液、阴炎净洗液标准汤剂和单味药材溶液色谱图见图2。

图2 混合对照品溶液、阴炎净洗液标准汤剂和单味药材溶液色谱图

3 讨 论

本研究考察了Agilent C18、Thermo Hypersil GOLD C18和ACE EXCEL C18-AR 3种色谱柱对目标化合物的分离效果。结果表明，采用Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱时，目标化合物的色谱峰数较少，峰形较差；采用Agilent C18色谱柱时，色谱峰数较多，但个别化合物色谱峰分离效果差，峰形差；采用ACE EXCEL C18-AR色谱柱时，色谱峰数目多，各目标化合物的分离效果和峰形均较好，故本研究最终采用ACE EXCEL C18-AR色谱柱进行后续实验。

此外，本研究还考察了不同流动相体系（乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-10 mmol/L磷酸二氢钠水溶液）的洗脱能力，发现采用乙腈-0.1%磷酸水溶液时，目标化合物的色谱峰多、信号响应较强，但峰形不好，个别化合物峰出现分裂；采用乙腈-10 mmol/L磷酸二氢钠水溶液时，目标化合物的色谱峰数多且分离效果好。

根据文献资料[19-22]，苦参碱、氧化苦参碱、咖啡酸、龙胆苦苷、黄柏碱、连翘酯苷A、表小檗碱、连翘苷、黄连碱、巴马汀、小檗碱、蛇床子素分别在220、220、327、277、220、330、345、220、238、345、265、322 nm处有最大吸收。文献报道[23]地肤子皂苷Ic多采用蒸发光散射检测器检测，本研究采用紫外检测器在低波长处（215 nm）对其进行检测，可获得良好的峰形和响应。综合比较上述9个波长，最终选择可测定的色谱峰数多、分离度好及峰响应值较大的215 nm作为检测波长。

本研究依据《医疗机构中药煎药室管理规范》和《湖南省医疗机构制剂规范》，考察了两种不同的阴炎净洗液标准汤剂的制备方法，并分别计算出膏率。第一种制备方法平均出膏率为8.76%，第二种制备方法平均出膏率为11.02%，故本研究选择第二种方法制备阴炎净洗液标准汤剂。

本研究建立的阴炎净洗液标准汤剂指纹图谱分析方法稳定、可靠，可用于阴炎净洗液的质量控制。