基于流式细胞术的兰属杂交后代倍性鉴定

冷青云 陆锦萍 黄少华 徐世松 李海燕 牛俊海 尹俊梅

关键词：流式细胞术；兰属；倍性鉴定

兰属（CymbidiumSw.）是兰科（Orchidaceae）重要观赏类群之一，原生种约86种[1]，主要分布于亚洲热带和亚热带地区，向南到澳大利亚北部，中国是该属的分布中心和多样性中心，分布于秦岭山脉以南地区，约有63种[2]。种内品种及种间杂种和品种间杂交种超过2万种，截至2022年，在国际兰花杂种登录权威机构（InternationalRegistrationAuthorityforOrchidHybrids，RHS）上登录的兰属植物杂交种有超过17363个[3]。

兰属育种方式有选择育种、杂交育种与诱变育种等，其中杂交育种是兰属植物的主要育种手段。在杂交育种工作中，了解亲本及杂交后代的倍性和育性十分重要，有利于提高育种的成功率。通过染色体计数法对一些兰属原生种及杂交品种（杂交兰和大花蕙兰）进行倍性鉴定研究，原生种及杂交兰主要是二倍体，大花蕙兰（Cymbidiumhybridium）的染色体倍性多样化，有二倍体、三倍体、四倍体、六倍体和非整倍体[4-10]。然染色体计数法对细胞学操作技术要求较高，且费时费工，面对大规模种质资源及杂交后代群体的倍性鉴定需要寻找一种快速便捷、高通量鉴定的方法。

流式细胞术（flowcytometry，FCM）是20世纪70年代发展起来的一种对悬浮的单细胞进行高速分析和分选的技术。在植物学研究中，常用于倍性分析、细胞计数、细胞周期分析及植物基因组大小估算等研究，具有分析速度快、灵敏度高、可靠性好等优点[11-12]。近年来在红掌[13]、香蕉[14]、橡胶[15]、火龙果[16]、茉莉花[17]、桂花[18]、三角梅[19-20]等植物倍性鉴定中应用。在兰科植物研究中，已有超过26属70种的基因组大小是通过FCM评估，包括兰属、兜兰属（Paphiopedilum）、树兰属（Epidnedium）等[21-25]，另外，FCM也应用于对化学诱变剂处理后的蝴蝶兰（Phalaenopsis）、石斛（Dendrobium）、白芨（Bletilla）倍性鉴定[26-29]。本研究通过流式细胞术对兰属3个杂交后代群体进行倍性鉴定，以期为快速鉴定杂种后代倍性提供技术方法，并获得优良的多倍体植株，为今后的多倍体育种提供种质材料。

1材料与方法

1.1材料

试验材料为亲本黄金小神童（CymbidiumGoldenElf.‘Sundust）、冬风兰（CymbidiumdayanumRchb.f）、美花兰（CymbidiuminsigneRolfe）以及其杂交后代群体，其中，黄金小神童为杂交种，其他为原生种，具体组合及杂交后代数量见表1。所有材料均保存于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所八队热带花卉种质资源圃。

1.2方法

1.2.1兰属流式细胞术倍性检测技术体系构建裂解液种类、试验材料组织部位是影响倍性检测的关键环节。本试验应用了3种裂解液Galbraithsbuffer（GLB）（30mmol/LNa3C6H5O7·2H2O、45mmol/LMgCl2、20mmol/L3-[nmorpholino]propanesulfonicacid]、0.1%TritonX-100（w/V），pH7.0）、WoodyPlantBuffer（WPB）（0.2mol/LTris-HCl，86mmol/LNaCl，10mmol/L焦亚硫酸钠，4mmol/LMgCl2·6H2O，2mmol/LEDTANa2·2H2O，1%PVP-10，1%（V/V）TritonX-100，pH7.5[26]、CyStainUVPreciseP试剂盒，以黄金小神童幼嫩叶片、根尖组织、花梗、花萼片为材料，利用流式细胞仪测定相对荧光强度（relativefluorescenceintensityofPI-stainednuclei，FL）和G0/G1期的變异系数（coefficientofvariation，CV），筛选出最适合裂解液及组织部位，每个处理重复3次。

1.2.2兰属杂交后代流式细胞术倍性检测基于黄金小神童为试验材料构建的兰属流式细胞术倍性检测技术体系：解离液为CyStainUVPreciseP，幼嫩叶片为试材，检测其倍性。

将样品置于含1.0mL预冷的GLB解离液的培养皿中，用锋利的刀片切碎，2min后用300目尼龙网过滤，滤液加入预冷的碘化丙啶（PI）和RNAase溶液，工作浓度均为50μg/mL。置于冰上避光染色0.5～1h后上机检测，仪器为SysmexCyFlow?PloidyAnalyser，激发光为488nm，每次检测收集5000个颗粒，仪器自带软件作图分析，变异系数控制在5%以内。每份材料重复3次。

1.2.3不同倍性气孔形状观察叶片气孔大小和密度比较：取不同倍性叶片，在叶片下表皮均匀涂上一层透明指甲油，待指甲油干后，用镊子挑取其表皮置于有蒸馏水的载玻片上，吸取多余的水分，加盖玻片后在LeicaDM2500生物显微镜40×物镜下观察测量。每片至少观察10个视野，记录每个视野内气孔器的个数，每片选取30个气孔，测量每个气孔器的长度和宽度。

2结果与分析

2.1兰属流式细胞术倍性检测技术体系构建

2.1.1不同裂解液对细胞核解离的影响以黄金小神童嫩叶为供试材料，利用流式细胞仪研究3种裂解液对兰属植物的裂解效果（图1，表2），发现3种裂解液均能较好地保证完整的细胞核从破碎细胞中裂解出来，同时可降解细胞中的次生代谢产物。对于FL值，3种裂解液有显著差异，其中GLB裂解液裂解样品得出的FL值最低，最高的FL值出现在CyStainUVPreciseP裂解的样品中，且显著高于另外2个裂解液。在用3种裂解液对兰属进行流式分析中，CV值差异不显著，最高的为WPB裂解液，CV值为5.66%，大于5%；最低为GLB裂解液，为3.93%。裂解液的选择标准为有最高的FL值和最低的CV值，通过表2发现，CyStainUVPreciseP在3种裂解液种中最佳。从图1也可看出，CyStainUVPreciseP制备的样品流式细胞图出峰清晰、稳定、杂峰少，并且可以清晰地观察到G2期。因此，选定CyStainUVPreciseP试剂盒为本研究后期的裂解液。

2.1.2不同组织部位对植物倍性的影响本研究分别使用植株的嫩叶、根尖、花梗和花萼片来验证不同组织器官对植物倍性检测结果准确性的影响。由图2可知，4种组织器官均能裂解出细胞核，嫩叶和花梗有一个明显峰值，其峰值清晰，细胞碎片少，根尖和花萼片流式DNA含量直方图显示出2C、4C、8C共3个峰值，根尖在2C、4C处峰值等高，花萼片的主峰值出现在4C处，是叶片主峰值的2倍，这2种组织呈现体内多倍化现象，不适合作为兰属倍性检测的组织材料，花梗能较好地出峰，也无多倍化细胞干扰，但其取材时间只能在开花期特定时间采集，而叶片可以在任何季节取材，是理想的兰属倍性检测组织部位。在后续的研究中选择以幼嫩叶片为材料开展流式细胞术检测。

2.2兰属杂交后代流式细胞术倍性检测

以CyStainUVPreciseP试剂盒为裂解液，利用流式细胞仪对3个亲本及其杂交后代进行倍性检测。测定结果见图3，3个亲本流式细胞图出峰清晰、稳定、杂峰少，荧光强度在12251～13509之间，差异不大。因3个亲本均为二倍体，将杂交后代DNA相对含量峰值在12800左右定为二倍体，三倍体峰值在19200左右和四倍体峰值在25600左右。杂交后代倍性检测统计结果见表3，共检测出多倍体8株，其中黄金小神童×美花兰后代检测出三倍体1株，占比为1.02%；（黄金小神童×冬凤兰）×美花兰后代检测出三倍体5株，占比8.92%；四倍体2株，占比3.57%。

2.3不同倍性气孔形状比较

兰属二倍体、三倍体和四倍体的气孔性状分析结果表明（表4，图4），不同倍性间的气孔长度、宽度和密度均差异显著（P<0.05）；气孔长度和宽度的排序为四倍體>三倍体>二倍体，而气孔密度的排序则相反。

3讨论

目前，流式细胞术是大规模检测植物倍性的有效手段，具有快速、准确、操作简便和可重复性强等优点。其中裂解液种类和试验材料组织部位是影响其准确性的关键因素。前人研究发现GLB对兰属裂解效果最好[24-25]。本研究在对兰属植物裂解试验中，发现CyStainUVPreciseP试剂盒裂解液是所用3种裂解液中效果最佳的，CyStainUVPreciseP为专利产品，配方成分未公开，且售价偏高，GLB含有柠檬酸钠和TritonX-100，能清除兰属植物叶肉细胞中含有大量的糖类、酚类等黏性物质，其裂解的细胞悬浮液也能出较好的峰值，因此在对兰属物种进行流式细胞技术测定时，无法获得CyStainUVPreciseP试剂盒裂解液的情况下，也可选择GLB进行试验。兰科普遍存在核内再复制现象[12]，兰属组织器官中也均存在多倍体化[30]。本研究所选的4种植物组织中，根尖和花萼片均存在不同程度的内源多倍体化现象，内源多倍体化在植物倍性鉴定中会造成倍性改变的假象，对结果的准确性产生影响；嫩叶和花梗出峰稳定，因嫩叶不受开花等影响，在幼苗期及成苗期均可以采样，是兰属倍性检测的最佳组织材料。

多倍体育种是观赏植物育种的重要方向之一。目前商业化的大花蕙兰品种多数为多倍体。不同倍性品种间杂交是兰属多倍体的主要选育途径，三倍体可由四倍体为亲本与二倍体杂交产生，四倍体由四倍体和四倍体杂交产生，二倍体品种间杂交也能产生四倍体的子代[8，10]。本研究在2个二倍体为亲本的杂交组合后代中检测到三倍体和四倍体，四倍体可能是由二倍体合子经体细胞加倍后发育成植株，三倍体是由未减数分裂的2n配子和经减数分裂n配子受精融合发育而成，其中2n配子来源于母本的概率大于父本，因为在获得多倍体杂交组合的母本均为杂交种，黄金小神童是建兰（C.ensifolium）和大花蕙兰（C.EnidHaupt）的杂交种，经多次杂交选育而成，具有50%建兰、12.5%美花兰和6.25%独占春的血统[英国皇家园艺学会（RHS）的兰科植物品种国际登录网]。有研究表明远缘杂交是获得高效发生2n配子资源的有效手段，杂交种在配子形成过程中减数分裂异常，出现2n配子概率显著高于原生种[31-32]。从本研究中杂交组合3比组合2出现多倍体比例高的现象，也可发现杂交代数越高，遗传背景越复杂，获得可育配子比例低，产生后代数量也相对少，但更容易出现多倍体。在兰属杂交育种中，亲本选择可以亲缘关系较远，亲本至少有一方是经过多代杂交后的杂交种，这样子代植株倍性会相对丰富。

染色体组的加倍会导致基因表达和调控的改变，从而造成植物形态和生理上的相应变化，如叶片变宽、变厚，花瓣变厚、颜色变深，气孔长度和宽度增大、密度降低、育性和抗性改变等。本研究发现，随着倍性的提高气孔的长度和宽度均增大，气孔密度变小。这与张源源等[33]在橡胶多倍体研究中的结果相似。而株型、花朵数量、大小和颜色、花期长短、抗性及育性等特性有待进一步观察。