流式细胞术及其应用

朱江巍

摘要：简述了流式细胞仪的结构、工作原理，以及流式细胞术在细胞学、免疫学、血液学等方面实际应用，并预测流式细胞术将会应用到动物医学中，造福畜牧生产业。

关键词：流式细胞术；工作原理；临床应用

中图分类号：R197.39 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2014）10-0068-02

1 流式细胞仪的结构及工作原理

流式细胞仪主要分为科研型（又称大型机、分析型）和临床型（又称小型机、台式机）两类，科研型的仪器功能齐全，分析灵活，但操作较繁琐，必须由经过培训的专业人员进行操作；临床型的仪器易于操作，稳定性好，分析速度快，适合在临床实验室应用。流式细胞仪主要由以下五部分构成：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束形成系统；③光学系统；④信号检测与存储、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。其主要技术指标有分析速度、荧光检测灵敏度、前向角散射（FSC）光检测灵敏度、分辨率、分选速度等。流式细胞仪的工作原理是将待测标本制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入充满流动的鞘液；当鞘液压力和样品压力的压力差达到一定程度时，在鞘液的约束下细胞排列成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱经过激光聚焦区，与入射的激光束垂直相交，经特异性荧光染料染色的细胞被激光激发产生特定波长的荧光；仪器中一系列光学系统，如透镜、光阑、滤片和检测器等，收集荧光、光散射、光吸收或细胞电阻抗等信号；计算机系统进行收集、储存、显示并分析被测定的各种信号，对各种指标做出统计分析。科研型流式细胞仪还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来，其分选原理是把液滴形成的信号加在压电晶体上使之产生机械振动，流动室即随之振动，使液柱断裂成一连串均匀的液体。一部分液滴中包有细胞，而细胞特征是在进入液滴以前已经被测定了的，如果其特征与被选定要进行分选的细胞特征相符，则仪器在这个被选定的细胞刚形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷，使被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷，而未被选定细胞形成的细胞液滴和不包含细胞的空白液滴不被充电。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，按照所带电荷符号向左或向右偏转，落入指定的收集器内，完成分类收集的目的。对分选出的细胞可以进行培养或其他处理，做更深入的研究。

2 临床应用

2.1 在肿瘤学中的应用

流式细胞术的出现给肿瘤的病理学诊断带来了飞跃，特别是用流式细胞术分析细胞DNA含量，分辨率高、精确度好，可为判断肿瘤的生物学行为提供客观而准确的资料，辅助肿瘤的早期诊断和鉴别诊断。癌前病变是指某些具有癌变潜能的病变，正确识别癌前病变对早期诊断和预防恶性肿癌具有重要的实际意义。有人发现流式细胞术检测肿瘤胸腔积液DNA指数、RNA指数、PCNA的流式细胞术检测结果对于恶性胸腔积液的诊断具有一定的价值，特别是对于部分细胞学检测阴性的恶性胸腔积液的诊断可能具有重要的临床意义。DNA、RNA同时检测对于诊断DNA正常而RNA发生异常改变的恶性胸腔积液具有重要价值，可以弥补单项DNA检测的不足。三者联合检测对于恶性胸腔积液的诊断价值大于单项或两项联合检测，具有较低的漏诊率和误诊率。有人通过研究发现流式细胞术可以准确地对细胞周期蛋白在临床实体瘤中的表达进行定性、定量、定位的分析，较为系统地反映了细胞周期蛋白在临床实体瘤中的表达特性和肿瘤的生物学特性。还有人发现流式细胞术可以提高颈淋巴结隐匿转移的检出率，与半连续切片HE染色法有差异，可以作为口腔鳞癌颈淋巴结隐匿转移的检测方法。隐匿转移与肿瘤原发灶部位、病理分级临床T分期无相关关系。有人应用流式细胞术检测35例多发性骨髓瘤患者的细胞表面的CD38、CD138、CD19、CD56、CD45、CD44抗原的表达情况，可以区分骨髓瘤和良性浆细胞，是多发性骨髓瘤的重要诊断依据。

2.2 在免疫学中的应用

流式细胞术与单克隆抗体结合，对细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体的定量检测取得很大的进展，克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估有重要意义。此外，用流式细胞术检测红细胞、粒细胞抗体及血小板减少性疾病，均有检测速度快、灵敏度高、特异性强的优点。有人对25例肺癌患者和30例健康人的外周血淋巴细胞亚群的水平检测分析发现肺癌患者CD3+、CD4+细胞及CD3+、CD4+/CD3+、CD8+比值较对照组显著减少，CD3+、CD8+显著增多，因此流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚型抗原表达可作为肿瘤患者免疫监测的手段。还有人应用流式细胞术检测抗中性粒细胞CD16b和CD177抗体是自身免疫性中性粒细胞减少症实验简便、快捷的诊断方法，有助于自身免疫性中性粒细胞减少症的诊断、鉴别诊断和疗效判断。有人用钙离子荧光探针结合流失细胞术检测肉仔鸡肠道B淋巴细胞胞内Ca2+浓度，且二十五碳五烯酸（EPA）极显著降低了B细胞内的Ca2+浓度。此研究建立了肉仔鸡肠道B淋巴细胞胞内Ca2+浓度流式细胞术测定方法，为检测肉仔鸡肠道B淋巴细胞内其它离子成份奠定了基础。由此可以看出，流式细胞术正在逐渐的应用到畜禽中。

2.3 在血液学中的应用

流式细胞术通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析，对各种血液病的诊断、治疗和预后判断起到重要作用。流式细胞术采用各种抗血细胞表面分化抗原的单克隆抗体，借助于各种荧光染料测定一个细胞的多种参数，以正确地判断出该细胞的属性。各种血细胞系统都有其独特的抗原，当形态学检查难以区别时，免疫表型参数对各种急性白血病的诊断和鉴别就起了举足轻重的作用。流式细胞术还可以应用在白血病免疫分型方面。目前国内外均主张采用FCMCD45/SSC双参数散点图设计方法进行白血病免疫分型，采用此法可将骨髓细胞清晰地分成淋巴细胞、单核细胞、成熟粒细胞、幼稚细胞和有核红细胞群，这样可以排除正常细胞对免疫分型的干扰，从而提高免疫分型的准确性。此外，流式细胞术在网织红细胞的测定及应用、血栓与止血中的应用、微小残留病灶（MRD）的检测等方面均有广泛的应用。

2.4 在其他方面的应用

随着近年来流式细胞术的发展以及与临床工作结合的紧密性日益加强，FCM已广泛应用于临床医学，通过对多药耐药基因、凋亡抑制基因及凋亡活化基因表达的测定、检测器官移植后血液或移植内免疫成分变化、与荧光染料联合应用判断细菌的活力和功能状态等方法，在细胞凋亡和多药耐药基因检测、器官移植、临床细菌学、细胞生物学、优生遗传领域等都得到了充分的应用，有着广阔的前景。念珠菌是人类最常见的条件致病菌，也是院内感染的主要病原菌。近年来随着广谱抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤化疗药物等的广泛应用，其感染率不断上升，菌种也在不断的变迁，因此选择快速、简便的药敏试验方法测定抗真菌药物对病原性真菌的抑制活性，为临床选择用药提供依据，从而有效的预防和控制真菌感染。有人用流式细胞术快速检测30株白色念珠菌分离菌株对伊曲康唑的敏感性，发现本方法具有很好的重复性。流式细胞术具有快速、敏感、可靠的优势，在临床抗真菌药物敏感性检测中具有很大的应用前景。也有人利用流式细胞术检测疟原虫感染患者的血液红细胞，建立了一种新的疟疾辅助诊断技术。还有人应用流式细胞术对36株临床分离已经确定为产超广谱β-内酰胺酶的菌株进行药敏试验检测，发现该方法与传统方法检测结果具有一致性，但是更为快速客观、便于自动化，在联合药敏试验方面有较大的临床应用前景，为流式细胞仪应用到细菌药敏试验奠定基础。

3 结语

流式细胞术以其分辨率高、分辨细胞数量大、参数多、准确性高、速度快等优点而广泛应用于生物医学研究中，并逐步成为医学临床检验领域中极具发展潜力的高技术平台。随着流式细胞分析技术与方法的迅速发展，流式细胞术在临床的应用范围也不断拓展，并将成为推动临床医学发展的重要手段之一。随着经济的发展、社会的进步以及人们生活水平的提高，流式细胞术将会应用到动物医学中，造福畜牧生产业。