台湾独蒜兰生长发育过程中源库关系转换研究

韩茹 游乐 江鸣涛 汪得凯 陈妮 翟俊文 吴沙沙

关键词：台湾独蒜兰；假鳞茎；羧基荧光素；源库转换

同化物的运输和分配是影响作物产量及品质的重要因素[1]。1928年，MASON等[2]提出了影响作物产量的源库理论。经典的源库理论认为：源（source）是指产生或输出同化物的器官或组织；库（sink）是指利用或贮藏同化物的器官和组织[3]。同时根据碳水化合物输入作物生长中心器官的特点，一般将生长中心器官定义为库；为生长中心器官提供营养物质的器官定义为源[4]。植物体源库关系与植株的生长发育息息相关[5]。源与库之间功能上的相互作用及其能力大小，直接影响到作物的产量和质量。

假鳞茎指兰科植物变态的茎，通常肉质，呈卵球形至椭圆形。作为兰科植物区别于其他科植物最典型的结构特征，假鳞茎是水分、碳水化合物和矿物质的重要贮存器官，因此它们在营养物质供给、调节兰花的光合作用、花发育及果实成熟等营养和生殖生长阶段有着十分关键的作用[6]。当兰科植物遭受水环境胁迫时，假鳞茎往往会发挥其作为“储水库”的作用，从而使兰科植物免受干旱的胁迫影响。当然，不同年龄阶段的假鳞茎在干旱胁迫下的形态和生理特性也会表现出很大的差异[7]。可见，在兰科植物的整个生长发育过程中，假鳞茎始终扮演着不可替代的作用。

与此同时，在兰科某些植物当中，对同化物的运输与卸载路径也已经有了部分相关研究。如：通过研究一卡特兰杂交品种（Laeliocattleya‘Tirlemont×Cattleya‘Whitepearl）的光合器官和生殖器官之间的碳平衡，确定出花发育和形成直到花瓣褪色过程中同化物主要来自假鳞茎和老叶中的碳源[8]；通过探究单茎兰杂交种（ArandaTaySweeEng）同化物运输和卸载途径发现，花序和营养枝的顶端会同时竞争来自完全展开叶片的同化物，且完全展开的叶片是此时植株最主要的源器官[9]。然而，目前对于假鳞茎的存在与源库转换之间的相关性还鲜见报道。而在园艺生产实践中，了解清楚假鳞茎的结构、功能与源库转换之间的关系对改善兰科植物的栽培和培育工作具有重要的指导作用。

独蒜兰属（Pleione）为兰科（Orchidaceae）重要观赏植物，全属约有24种9个天然杂交种，中国有19种4个天然杂交种，主要分布在中国的云南、四川、西藏、福建、台湾等地以及缅甸、泰国、老挝[10-11]。该属植物最典型的特征就是假鳞茎每年更新，且假鳞茎结构简单。台湾独蒜兰（P.formosana）为独蒜兰属最易栽培且已在中国台湾地区实现规模化人工栽培的物种，具有先花后叶的特征，通常1株仅有1个假鳞茎、1个花芽和1个叶芽，随着植株的不断生长和发育，2个芽的基部膨大形成新的假鳞茎作为翌年的生长中心[12]。根据台湾独蒜兰在生长过程中外部形态变化特征可划分为休眠期、盛花期、旺盛生长期和半枯期。在休眠期，植株停止生长，叶片枯萎凋落，地下假鳞茎连同其基部的芽处于休眠状态；盛花期集中在3月中下旬到4月中旬，由于其具有先花后叶的特性，花期时叶子未开始生長或处于幼嫩状态；叶片在花凋谢后快速生长，处于旺盛生长期，此时授粉成功的子房膨大发育形成果荚，叶片基部开始膨大形成新的假鳞茎作为翌年的生长材料。在叶片半枯期，果荚已经成熟，此时新球已变得饱满充实、同时母球顶端的顶芽球也逐渐膨大，植株完成了有性和无性繁殖，为第二年的生长做好了准备[13-15]。在其生长更新过程中植株各个部位承担着源和库的功能，且呈现出动态变化，尤其是作为世代交替的假鳞茎在其中发挥的作用及如何更好地利用源库理论为栽培生产提供科学合理的措施值得深入研究。

荧光示踪技术使用的示踪剂羧基荧光素（CFDA）是一种无毒害的活细胞染料，符合标记原理的任何植株部位都能被追踪到，同时操作方便快捷，使用成本较低；最重要的是荧光染料与光合同化物的结合发生特定反应使得光合同化物的卸载运输途径探究精准化、可视化。通过激光共聚焦显微镜的观察使得实验结果更加明显，清晰可靠，具有广泛的应用价值。

因此，本研究以台湾独蒜兰为研究对象，分别在休眠期、盛花期、旺盛生长期和半枯期4个时期，利用CFDA荧光示踪技术和激光共聚焦显微镜观察，明确植株不同部位间的源库转换关系及同化物的运输方向，确定出台湾独蒜兰在生长发育过程中源库关系转换以及不同器官或组织在不同时期担任的源、库功能。

1材料与方法

1.1材料

本研究以台湾独蒜兰假鳞茎为材料，选用课题组于2015年9月无菌播种组培苗栽培3年的直径为（3.0±0.5）cm成熟假鳞茎。根据台湾独蒜兰生长状况，分别于休眠期（2020年2月20日，图1A）、盛花期（2020年4月11日，图1B）、旺盛生长期（2020年6月15日，图1C）、半枯期（2020年11月14日，图1D）4个时期进行试验。

在这4个时期分别从不同的部位导入CFDA荧光染料（表1），各个时期每个引入部位均在3株不同植株上进行3个生物学重复。引入及检测部位选择依据：参照台湾独蒜兰生长发育过程中的物候特征，选择有代表性或仅有的植株部位进行荧光导入和检测。导入部位的选择不表示该部位就是源器官，只是为了进一步验证试验前期提出的假设是否成立。

1.2方法

1.2.1CFDA标记方法为了研究台湾独蒜兰在不同生长发育过程中的源库转换变化，本研究利用CFDA示踪技术，对同化物的运输方向和路径进行研究，从而确定植株不同部位所担负的源或库的功能。从母球、新球、唇瓣基部或叶背中部的韧皮部将CFDA引入到植物体内。用双面刀在假鳞茎的中部横切出1条0.3mm宽的楔形切口，深度以贯穿维管束为准。当从叶片或者唇瓣基部引入时，则用耐水细砂纸（360#）将叶背或侧瓣外侧轻轻摩擦，以磨破维管束为准[16]。后将浸泡有120μL浓度为1mg/mLCFDA丙酮饱和溶液的一小块医用脱脂棉塞入假鳞茎的切口，或者平铺在叶背或侧瓣外侧的维管束横断面处，让溶液随着筛管运输，并迅速用锡箔纸包裹假鳞茎或叶片，避免光照以防止荧光物质淬灭和丙酮溶液挥发（图2）。

1.2.2组织切片及显微观察引入CFDA溶液的植株经过代谢72h后，用自来水洗净并擦干，采取徒手切片法，用双面剃须刀片切取假鳞茎、鳞茎盘、叶柄等部位，切片后立即置于滴有80%甘油液滴的载玻片上以防止染料卸出丢失，盖上盖玻片进行观察[17]。在激发光488nm下使用FluoViewFV1200激光共聚焦扫描电子显微镜（Olympus，日本）和OlympusSIMscanner扫描器观察并拍照，用AdobePhotoshopCC（CreativeCloud）软件进行图片处理[18]。

2结果与分析

2.1休眠期同化物运输方向

休眠期自假鳞茎中上部引入CFDA，在假鳞茎侧边中下部（图3A、图3B）、通往鳞茎盘的筛管（图3C、图3D）、鳞茎盘底部（图3E、图3F）均检测到了连续的CF绿色荧光，其中在鳞茎盘底部检测到的荧光最强。说明此时同化物通过筛管向鳞茎盘底部运输，在此过程中无卸出。在假鳞茎与芽相接处（图3G、图3H）、芽内（图3I、图3J）2个部位均检测到了大量的CF绿色荧光，且明显强于在假鳞茎中检测到的荧光。说明假鳞茎中的同化物通过鳞茎盘后再运输到芽。此时假鳞茎作为唯一的源，为芽的后续生长发育提供营养物质，此时芽为整个植株最主要的库。

2.2盛花期同化物的运输方向

2.2.1从假鳞茎导入CFDA盛花期自假鳞茎导入CFDA，在假鳞茎中部（图4A、图4B）和底部（图4C、图4D）均检测到了少量的荧光信号，且底部的荧光要比中部更强。在新芽（图4E、图4F）和叶（图4G、图4H）中仅检测到非常弱的绿色荧光，说明叶和新芽并不是主要的库。而在花器官中，花梗（图4I、图4J）、柱头（图4K、图4L）、子房（图4M、图4N）这些部位均检测到大量的CF荧光。这些现象充分表明，在盛花期，假鳞茎作为源，花器官作为主要的库，同化物由假鳞茎通过鳞茎盘后最终会向花器官运输。与此同时，新芽、叶与花器官之间也存在着一定的竞争关系。

2.2.2从花瓣导入CFDA自花瓣导入CFDA，在柱头子房连接处检测到了大量的绿色荧光（图5A、图5B），说明此时来自假鳞茎的同化物主要向花器官运输。而在假鳞茎顶部（图5C、图5D）、中部（图5E、图5F）、底部（图5G、图5H）几乎检测不到绿色荧光，表明同化物并未出现向假鳞茎运输的现象。因此，在盛花期同化物主要由假鳞茎向花器官运输，以满足花器官的生长发育及果实形成所需，且同化物为单方向运输。

2.3旺盛生长期同化物的运输方向

2.3.1從母球导入CFDA在旺盛生长期由母球导入CFDA，仅在母球底部和顶芽检测到极弱的荧光，其他部位未发现荧光信号。由于荧光极弱，故未用图片呈现。

2.3.2从新球导入CFDA旺盛生长期由新球导入CFDA，在新球底部（图6A、图6B）、上部（图6C、图6D）、顶芽（图6E、图6F）以及母球上部（图6G、图6H）均检测到较弱的绿色荧光，这种现象表明此时新球并不是主要的库，同化物从新球运输到母球也不是主要的运输方向。而在母球与叶片连接处（图6I、图6J）检测到大量的CF荧光，并且该处是所有部位中检测到荧光量最多的，说明母球的顶芽与叶片连接处才是这一阶段主要的库。这与台湾独蒜兰的繁殖方式密切相关。在旺盛生长期，随着母球的营养消耗，母球顶部会形成新的2～3个小的假鳞茎（称为顶芽球），以进行无性繁殖。

2.3.3从开花新球叶片导入CFDA在旺盛生长期由花梗基部膨大形成的开花新球对应的叶片导入CFDA，在导入球叶柄连接处（图7A、图7B）检测到明显的荧光，在新球上部（图7C、图7D）、新球新芽连接处（图7E、图7F）仅检测到较弱的荧光，说明此时叶片作为源器官，同化物主要向叶结构部位运输，仅有少量同化物供应新芽生长。在另一个尚未开花的新球叶柄处（图7G、图7H）也检测到了大量的CF荧光，说明同化物也会向另一新球方向运输，促进该球叶片生长。

与此同时，在母球顶部（图7I、图7J）、中部（图7K、图7L）、底部（图7M、图7N）3部分中均检测到少量的绿色荧光。这些现象表明，同化物会从导入球经过母球向另一个新球运输，同时有少量同化物向母球中上部运输，以提供母球顶端形成顶芽球所需的营养物质。

2.4半枯期同化物的运输方向

2.4.1从母球导入CFDA在半枯期自母球导入CFDA后，发现在母球的上部（图8A、图8B）和下部（图8C、图8D）仅存在微量绿色荧光，说明此时大部分同化物向其他部位进行运输，仅留有很小一部分的同化物维持母球的生活。对其中一个新球各部位进行检测发现，其中上部（图8E、F）、叶柄（图8G、图8H）、新芽（图8K、图8L）以及新芽连接处（图8I、图8J）等部位都有大量绿色荧光存在。同时，发现另一个新球上部（图8M、图8N）荧光覆盖范围更大。说明此时2个新球均作为库储存同化物，但出现了同化物不均等分配的现象。

2.4.2从新球叶片导入CFDA由新球叶片导入CFDA，在对新球和母球各部位进行检测时发现，新球上部（图9A、图9B）和叶柄（图9C、图9D）处发现较多的绿色荧光，而新球与新芽连接处（图9E、图9F）几乎看不到绿色荧光。这一现象说明同化物会向新球假鳞茎输送，而没有向新芽运输的趋势，此时新的假鳞茎作为一个库积累部分同化物；与此同时，在另一个新的假鳞茎中部（图9G、图9H）、新球叶柄处（图9I、图9J）和新芽连接处（图9K、图9L）均发现了大量的荧光，说明这一新球是半枯期最主要的库，它具有更强的竞争优势；在母球上部（图9M、图9N）也看到了部分绿色荧光，这说明母球顶端的顶芽球会对其他新球的生长产生较大影响。因此，在半枯期，同化物会向2个新球以及母球顶端方向进行运输，新球是主要的库，且较小的新球是最重要的库。

3讨论

光合同化物的分配和运输方向在很大程度上可以决定开花质量、作物的产量和品质[19]，因此探究同化物在不同时期的运输方向和目的就成为研究者重要的关注点。本研究利用CFDA结合激光扫描共聚焦显微技术来研究台湾独蒜兰4个发育时期同化物具体的运输情况，通过同化物的运输方向确定在不同时期不同组织或器官所承担的源、库功能。

3.1独蒜兰同化物运输途径

目前，对兰科植物的源库关系研究已经有了一定进展。如利用14CO2定量测定技术探究在深山紫兰（Spathoglottisunguiculata）和白苇兰（Bromheadiafinlaysoniana）中源库光合同化物的分配模式，通过对二者营养生长期、开花期、结果期3个不同生长阶段同化物的分配情况进行观察和比较，结果在2种兰花中同时发现，生殖期的花序和营养生长期的腋芽中都具有最高的库活性和同化物含量；与此同时，正在发育中的花序也要比已经成熟的花序具有更高的库活性。因此得出花器官是深山紫兰和白苇兰同化物储存最主要的库器官这一结论[20]。同样，在文心兰品种（Oncidium‘Goldiana）中也得出了相同的结论[21]。

而光合同化物的运输途径具体包括3种方式：共质体运输、质外体运输以及二者交替式运输[22]。如：梨（Pyrussp.）[23]、苹果（Maluspumila）[24]、猕猴桃（Actinidiachinensis）[25]等果实的同化物都以质外体途径进行运输；而葡萄（Vacciniumuliginosum）[26]、文冠果（Xanthocerassorbrifolia）[27-28]、枣（Ziziphusjujuba）[29-30]等果实的同化物运输在不同发育时期存在着共质体途径和质外体途径的相互转化。如冬枣、葡萄等在发育早期为共质体运输，到了中期同化物转变成质外体途径运输。前期课题组的研究通过对台湾独蒜兰假鳞茎的超微结构进行观察，发现筛管和伴胞之间是通过胞间连丝相联系的，证实了在休眠期台湾独蒜兰的假鳞茎主要以共质体途径进行物质运输[12]。

3.2独蒜兰源库资源分配与竞争

在休眠期观察到从母球导入的荧光在经过鳞茎盘之后最终会到达母球与芽的相接处、芽内等部位，这充分说明了母球中储存的营养物质主要供给新芽的生长。在此时期的营养分配较单一、明确，无资源竞争现象出现。

在盛花期观察到从母球导入的荧光在新芽、叶以及花器官中有较强的信号，其中花器官中的信号最强。这表明了新芽和叶的生长与花器官之间存在着明显的资源竞争，但更多的资源还是用来供给花器官的发育以保证开花的数量和质量。在对东方百合（LiliumOrientalhybrid）不同时期的碳同化分配情况进行研究时发现，含苞期时的同化物主要在花苞部位处积累，以满足开花所需要的能量，而在花后期，植株的光合产物主要用于供给百合鳞茎的发育和膨大[31]。

在旺盛生长期观察到从新球导入的荧光在母球与叶片连接处有较强的信号，这是因为这一阶段母球的顶部会形成2～3个新的假鳞茎（顶芽球），同化物表现出这样的运输路径主要是为了满足无性繁殖的营养需要；同时从开花新球叶片导入的荧光在母球中也检测到了信号，说明此时母球作为一个“加油中转站”，会有部分同化物卸出供其自身的生长。在这一时期，母球和新球之间是相互依赖又相互竞争的，依赖体现在母球吸收的物质也会运输给新球，而竞争则体现在二者都会同时去吸收养分，尽管发现母球的吸收效率远低于新球。在其他植物的营养资源竞争与分配研究中，也有出现竞争同化物的现象。对唐菖蒲‘RoseSupreme（Gladiolus‘RoseSupreme）盛花期时的营养分配情况进行研究时发现，花序与新球会同时竞争来自叶片的同化物[32]。为了保证地下器官的健康生长，生产上常常会选择在盛花期时去除花序，从而减少对养分的消耗以及与地下器官之间的资源竞争。

在半枯期观察到从母球导入的荧光在新球1和新球2中都有较强信号，且在新球2（较小籽球）中信号最为明显，这说明2个新球之间存在着明显的资源竞争；同时从新球叶片中导入的荧光在母球的上部也检测到了信号，这主要是为了满足母球顶端新长顶芽球的营养需求。

因此，资源竞争主要体现在3方面：（1）新芽、叶与花器官之间；（2）新旧假鳞茎之间；（3）2个新球之间。其中，新旧假鳞茎的资源竞争体现了假鳞茎世代更新的特性。当新旧假鳞茎同时存在时，二者均能吸收营养物质，但是新球会比母球吸收更多的养分以保证之后其他器官的需要，而完成使命任务的母球在一段时间之后就会枯萎死亡，此时的新球又会成为下一阶段的母球，如此反复进行世代更替，新旧假鳞茎之间交接完任务后就会选择继续存活还是生命终结。对球根花卉同化物的研究中也发现存在类似现象，但略有不同。例如在唐菖蒲的生长发育过程中，虽然新球与籽球会同时竞争同化物，但是相对而言，新球仍然扮演“源”的角色将营养物质运输给籽球[32]。另外，在对艳花独蒜兰（Pleioneaurita）进行研究时发现，其果实和叶片之间也存在资源竞争的现象，这是因为果实在叶片旺盛生长期就已经开始发育，此时的果实生长需要一定的营养物质作为支撑[33]。而本研究因未对台湾独蒜兰的果实进行同化物分配研究，故无法比较其异同之处。

3.3假鳞茎的功能与指导人工栽培

兰科植物中的假鳞茎既可以作为营养器官，又可以作为繁殖器官存在。在储存养分、水分的同时还能生根发芽，促进植株的纵向生长[34]。作为储存水分、碳水化合物以及矿物质的器官，假鳞茎对兰花的生长发育至关重要。首先，假鳞茎作为一个“水库”，能够使兰花在干旱胁迫的情况下及时补充水分，维持整个植株的水分平衡；其次，假鳞茎中储存的养分可以供给植株顺利完成光合作用、开花和繁殖[35-37]。

在独蒜兰属植物休眠期的假鳞茎超微结构中观察到了淀粉粒的存在，这说明碳水化合物在休眠期的假鳞茎中主要以淀粉的形式存在，为这一时期的生长发育提供必需的营养物质[12]。这一结论在荧光信号的检测中也得到了证实。与此同时，假鳞茎在獨蒜兰属植物的氮素经济中也有着重要作用。在艳花独蒜兰的假鳞茎氮素分配和吸收的定量研究中发现，当外源氮素营养和母球中储存的氮同时存在时，果实会优先吸收老球中的氮源[33]。

本研究通过对台湾独蒜兰假鳞茎这一特殊结构在不同时期的功能进行研究，从而找到在特定生长时期可以采取的栽培管理措施，以保证植株正常的生长和繁殖，从而满足市场的需求。

在休眠期，假鳞茎作为唯一存在器官，对整个植株的存活有着决定性的作用。这一时期假鳞茎的大小决定着养分储存量的多少。而养分储存量的多少决定着后续开花的数量和质量，养分储备充足将为后续植株的生长和存活提供有效保障。因此在栽培生产中应给予台湾独蒜兰充足的光照和水分，浇水标准常以土表面湿润为宜。同时对其进行每月一次的松土处理以保证假鳞茎的大小和生长质量，使其拥有充足的营养储备以备后续的能量供给。

在盛花期虽然已经开始有叶片出现，但这时的叶片还不具备制造大量同化物的能力，母球仍然是作为源器官存在，以维持开花这一耗能的过程。在一些鳞茎类的球根花卉中，也有得出类似的结论。前人的研究发现，百合鳞茎只有生长到一定的大小范围才能满足植株开花的需求[22]。同时，对东方百合进行去花苞和未去花苞对比处理时发现，未去花苞植株的鳞茎淀粉积累进程要远远慢于去花苞植株，这是由于未去花苞植株的鳞茎生长需要消耗大量的淀粉。因此在栽培生产中，适当的去花苞处理对百合鳞茎的养分积累有极强的促进作用[31]。此外，对中国石蒜（LycorischinensisTraub）盛花期進行研究时发现，鳞茎的外层鳞叶作为“源”持续不断地向内部鳞叶提供养分，中层鳞叶作为“备用源”，待外层鳞叶营养耗尽时，能够及时的补给营养以满足生长发育中心—内层鳞叶的需要[38]。在这一时期的栽培管理中仍然要重点关注母球的生长状态，以保证开花所需的大量能量供给。

在旺盛生长期，叶片已经成熟成为植株主要的源，这时产生的同化物主要用于满足基部新球的膨大和母球顶端顶芽球的膨大，通过比较二者之间对于营养物质的需求差异，明确了栽培时叶面施肥的必要性[39-40]。为了保证叶片的生长质量，可以选择在晴朗天气的早上或下午使用磷酸二氢钾以1∶1000的比例进行叶面喷施，施肥频率为10～15天1次，以促进叶片的光合作用和同化物的积累。同时，由于这一时期的养分消耗量大，为了保证源器官的储备满足需求，生产栽培时也可选择去除顶芽球，以减少同化物竞争，将同化物集中于新球的膨大。

在半枯期，除了2个新球需要大量养分之外，通过新球的荧光导入在母球上部依然能检测到信号，说明此时的顶芽球生长依旧需要一定的养分供给，但此时母球已经不再作为源，新球顶端的叶片承担着这项任务。因此，这一时期的养护栽培可继续使用磷酸二氢钾进行叶面喷施，使叶片积累一定同化物供应顶芽球的生长。

4结论

以上结果表明，在不同的生长阶段源与库的部位各不相同。在休眠期，同化物从假鳞茎向新芽运输；在盛花期，同化物主要从假鳞茎向花器官运输，为植株的有性生殖提供能量；在旺盛生长期，同化物主要用于供给母球顶端顶芽球的生长；而在半枯期同化物主要从叶片向未开过花的侧芽运输。总体看来，发育时期不同，同化物的分配中心也不同[41]，运输方向也会存在着很大差异。

对台湾独蒜兰不同时期源库转换关系的研究发现，无论在任何生长时期，同化物的运输主要是为了促进有性繁殖[42-43]。台湾独蒜兰各组织或器官之间的源库转换关系，与植株的生长、发育、繁殖密切相关[44]。了解清楚台湾独蒜兰在不同生长发育时期同化物的运输方向，明确不同器官或组织所承担的源、库功能，将能有效解决今后人为栽培过程中的实际生产应用问题[45]，比如在休眠期和盛花期补给充足的光照和水分以保证假鳞茎的生长质量；在旺盛生长期和半枯期使用磷酸二氢钾以叶面喷施的方式促进光合同化物的积累，满足应用生产过程中的开花数量和品质，为今后指导独蒜兰属植物的人工栽培提供一定的参考依据[46]。