基于SSR荧光标记的杧果种质资源遗传多样性分析及分子身份证构建

唐玉娟 罗世杏 黄国弟 宋恩亮 李日旺 赵英 张宇 莫永龙 唐莹莹

关键词：杧果；TP-M13-SSR；遗传多样性；分子身份证

我国是世界第二大杧果（MangiferaindicaL.）生产国，近年来，我国杧果产业快速发展，截至2020年，全国杧果种植面积达32.3万hm2，产量约266万t，产值达205.2亿元（农业农村部农垦局2021年统计数据），杧果产业已成为我国热区主要农业支柱产业之一。丰富的种质资源是杧果新品种选育和产业发展的基础，据统计，目前我国保存有大约1000份杧果种质材料，保存量位居世界第二[1]。面对如此庞大的种质数量，如何有效进行鉴定区分及合理利用是目前亟待解决的问题。

形态学鉴定和分子标记鉴定是种质鉴定的常用方法。形态学鉴定由于易受环境影响，且需要鉴定者有一定的经验，在种质鉴定上存在难度。而分子标记具有多位点性、高变异性和稳定性等特点，被越来越广泛应用于种质鉴定。SSR（simplesequencerepeats）标记具有操作简便、准确可靠，重复性好等优点，被国际植物新品种权保护联盟（UPOV）推选为DNA指纹图谱构建的首选标记之一[2]。目前，SSR标记在国内已应用于苹果[3]、梨[4]、桃[5]、荔枝[6]等多种果树遗传育种研究的各个领域，在杧果研究中也有相关报道，如黄丽芳等[7]用筛选出的多态性引物对杧果实生资源进行SSR-PCR扩增，最终将116份资源划分为4个群组；周立等[8]利用课题组开发的功能性SSR分子标记对种质圃内的杧果材料进行遗传多样性分析，将43个品种划分为3个组。

分子身份证（molecularID）是在DNA指纹图谱的基础上提出的一种鉴定种质资源的方法，即将指纹图谱进行编码赋值，使每一份种质拥有一段特定的字符串，通过字符串对种质进行区分。国外OHTSUBO等[9]利用SSR分子标记的方法构建了水稻的分子身份证；PAN[10]利用21对SSR引物构建了1025份甘蔗种质资源的分子身份证数据库。国内祁伟[11]较早地应用ISSR和SRAP分子标记分别绘制了红麻与蓖麻DNA指纹图谱，并建立其分子身份证；在果树种质资源的分子身份证研究上，则是艾呈祥等[12]较早地利用10对SSR引物构建了38份甜樱桃种质的指纹图谱，将分子指纹赋值后建立品种的分子身份证，而后在桃[13]、葡萄[14]和梨[15]等果树上也进行过此类研究。目前关于杧果分子身份证研究较少，仅见王明等[16]和姚全胜等[17]利用SSR引物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法构建数字化指纹图谱。

TP-M13-SSR是近年发展起来的最新检测技术，结合了SSR技术和荧光检测技术的特点，具有高检测精度、高效率等优点，比目前广泛采用的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测技术准确性更高、重复性更好，可以进行高通量DNA的指纹品种鉴定。目前，基于SSR荧光标记的杧果种质遗传多样性分析和分子身份证构建研究国内外尚未见报道。本研究通过对杧果种质资源保护广西创新基地圃内保存的145份杧果地方品种、育成品种及其近缘野生种扁桃进行遗传多样性分析，构建个体独特的分子身份证，以期实现杧果种质资源的快速、准确区分，为杧果种质合理利用提供指导。

1材料与方法

1.1材料

145份种质均取自国家杧果种质资源保护广西创新基地，包括99份杧果，36份杧果近缘野生种扁桃（表1）。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取于2021年9月采集健康杧果叶片、扁桃叶片，参照王家保等[18]的方法提取DNA并进行检测。

1.2.2引物合成课题组前期通过简化基因组测序成功开发了杧果SSR标记（相关数据未发表），从开发的引物中筛选出12对扩增条带清晰、重复性好、稳定性高的SSR引物。实验所用SSR引物合成与加M13接头的TP-M13-SSR引物、5′端带有荧光标记的M13正向引物（5′-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′）均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2.3PCR扩增PCR扩增体系及程序参考高源等[19]稍作修改。PCR反应体系：模板DNA（20ng/μL）1μL，带接头正向引物（10μmol/L）0.1μL，带荧光基团的接头引物（10μmol/L）0.4μL，反向引物（10μmol/L）0.4μL，2×TaqPCRMasterMix5μL，ddH2O3.1μL，共10μL。

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，62～52℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环，每个循环降1℃；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，25個循环；72℃延伸20min，4℃保存待用。

PCR扩增产物经过纯化后在美国ABI3730基因测序仪上进行荧光检测，收集原始数据。

1.2.4数据统计与分析利用GeneMapper软件3.0分析ABI3730收集的数据，利用PopGen32和PowerMarker3.25软件计算遗传多样性指标和多态性信息含量，利用NTSYS2.10软件UPGMA方法进行聚类并构建聚类图。

1.2.5分子身份证构建将每对引物获得的等位基因数按从小到大顺序排列，依次从阿拉伯数字1开始赋值，超过9的从英文字母A开始赋值，将每份种质在12个位点的等位基因按照赋值编码表赋值，获得每份种质特有的字符串即分子身份证。

2结果与分析

2.1荧光引物扩增结果多态性分析

课题组前期通过简化基因组测序成功开发了杧果SSR标记，从开发的引物中筛选出12对扩增条带清晰、重复性好、稳定性高的SSR荧光引物（表2）。利用12对荧光引物对145份杧果种质进行扩增，计算获得遗传多样性指标和多态性信息含量（表3）。12对引物的观测等位基因数在3～11之间，其中引物Mgi061和Mgi135最多为11，平均等位基因数为6.25；有效等位基因数在2.2263～5.2468之间，平均值为3.2838；观察杂合度（Ho）为0.4122～0.6959，平均值为0.5858；期望杂合度（He）介于0.5527～0.8003之间，平均值为0.6725；Shannon指数（I）介于0.9815～1.9269之间，平均值为1.3383；Nei基因多样性指数（Na）介于0.5740～0.8094之间，平均值为0.6702。多态信息含量（PIC）分布范围在0.5036～0.7827之间，平均值为0.6396。上述结果表明，本研究筛选的12对引物在145份种质中的多态性较高。图1展示了部分种质在荧光引物Mgi061中的毛细管电泳图。

2.2杧果种质亲缘关系分析

基于SSR荧光标记扩增结果，用NTSYS2.10软件构建遗传聚类图（图2）。在遗传相似性系数为0.7060时，供试145份材料分为2个类群，I类群包含109108份杧果和20份扁桃，种质数量最多，占总数的88.90%；Ⅱ类群包括17份材料，全部为扁桃。

在遗传相似性系数为0.7330时，I类群分为5个亚群，I-1亚群为5个亚群中种质数量最多的一个，包含13份扁桃和51份杧果，杧果有来自美国的汤米阿琼斯、爱文、圣心、法斯希尔、海顿、红凯特，缅甸的水英达、阿某杧、新德隆、帕拉英达、马帅，印度的903、1号、秋实1号，中国广西桂热系列和龙州泰国杧、農院8号、良余1号、白皮杧、小红象牙、象牙22号、象牙、桂青杧、秋实2号，中国云南的云热302、阳红1号、勐底红杧、胭脂杧、云南矮杧、红苹、三蜜杧、杨杧，越南的奶油香杧实生、三色杧、越南西贡引，中国台湾的台农1号、杉林1号，古巴的大娃杧，中国四川的安宁红杧，泰国的暹罗杧，海南的兴热1号。I-2亚群较少只有4份材料，即中国广西的桂热杧120号，中国四川的新红2号，古巴的太太杧，缅甸的马切苏；I-3亚群包括40份材料，其中扁桃6份，其余34份杧果分别是中国台湾蜜桃杧、台农2号、台牙杧、金煌杧、贵妃杧、凤凰杧，泰国的泰引1号、3号、泰国14号、南逗迈4号、四季蜜杧、农桑，印度5号、6号、906号，中国广西的串杧、桂热杧08-10、四合象牙、本地红花杧、永乐1号，中国云南的虎豹牙、龙杧、菲杧、大青蜜杧、土杧，越南沙华绿、艾普、红杧，澳大利亚青杧，中国海南红玉，印尼海豹，巴基斯坦413，中国四川的桔橼杧。I-4亚群包括10份材料，来自中国四川的金龙、龙眼香杧、乳杧，中国云南的大头香杧、三年杧1号、硕帅杧，中国广西的柳州吕宋、桂热4号，缅甸的秋杧，印度的椰香；I-5亚群包括10份种质，扁桃1份，美国布鲁斯，印度杧7号、澳大利亚肯盛顿、spooer，巴基斯坦44，泰国金水仙，中国云南小菲杧，中国海南黄玉，中国广西桂热杧07-2。

遗传相似性系数是反映种质亲缘关系远近的重要指标。本研究计算得到各种质间遗传相似性系数变化范围为0.5676～1.000，平均为0.7417。其中爱文与印度杧1号遗传相似性系数为1.000，说明在145份材料中爱文和印度杧1号之间亲缘关系最近，遗传差异很小；扁桃田阳20-2与大头香杧和硕帅杧、金煌杧与桂热杧10-1的遗传相似性系数最小，都为0.5676，说明在145份材料中扁桃田阳20-2与大头香杧和硕帅杧、金煌杧与桂热杧10-1之间亲缘关系最远，遗传差异相对较大。

2.3杧果种质分子身份证构建

将每对引物获得的等位基因数按从小到大顺序排列，依次从阿拉伯数字1开始赋值，超过9的从英文字母A开始赋值，未获得等位基因位点的标记为0，将每份种质在12个位点获得的等位基因按照赋值编码表（表4）赋值，获得每份种质特有的字符串即分子身份证。例如荧光引物Mgi154在供试材料中共获得8个等位基因片段，其中最小片段为212bp标记为1，最大片段274bp标记为8，即可得到每份材料在引物Mgi154的字符串。以供试材料台农1号为例，在12个位点获得的等位基因为别119、124、158/167、177、113/131、216/219、152/155、216/222、293、233/239、253/274、296，其对应赋值为44、22、34、11、15、34、23、13、11、24、28、11，即台农1号的分子身份证为442234111534231311242811，各供试材料的分子身份证见表5。12对荧光引物可区分145份供试材料，鉴定率达到100%。

3讨论

TP-M13-SSR技术是近年发展起来的最新检测技术，它结合了SSR技术和荧光检测技术的特点，解决了传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测精度和效率低的问题。该技术已成功运用于苹果[20]、梨[21]等果树的亲缘关系及种质鉴定领域，目前尚未见此技术应用于杧果研究。本研究利用12对TP-M13-SSR荧光引物对145份杧果种质及其近缘野生种进行扩增，引物多态性分析结果显示12对引物PIC分布范围在0.5036～0.7827之间。PIC是衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标，当PIC>0.5时，该引物为高度多态基因座[22]。本研究选取的12对荧光引物PIC值均高于0.5，所有引物为高度多态性位点，12对引物PIC平均值为0.6396，此结果高于王明等[16]（0.49）和NAZISH等[23]（0.398）的研究结果，低于周立等[8]（0.661）和DILLON等[24]（0.720）的研究结果，说明TP-M13-SSR荧光引物可以为杧果的亲缘关系分析及种质鉴定提供研究数据。

本研究利用12对SSR荧光引物对145份材料进行扩增，计算得到各种质间遗传相似性系数变化范围为0.5676～1.000，平均为0.7417，可见种质间的遗传差异较大，亲缘关系较远。扁桃是我国特有的杧果近缘野生种，其表型性状与杧果不同。在遗传相似性系数为0.7060时，17份扁桃独聚为Ⅱ类，其余19份未按照种属关系聚在一起，而是与来自中国广西和云南的杧果交叉相聚于I类群，这与谢江辉等[25]和罗海燕等[26]的研究结果相似，究其原因可能是杧果存在适应性进化，其与不同种源的扁桃基因相互渗透，引起种源基因的异质性。在遗传相似性系数为0.7330时，可进一步将I类群分为5个亚群，其中I-1（包含51份杧果种质）和I-3（包含40份杧果种质）2个亚群种质数量最多，占所有杧果种质（共计99份）的91.92%。I-1亚群中杧果种质主要来自美国、印度、缅甸、中国广西和云南（共计42份，占82.35%），I-3亚群主要来自中国台湾、泰国、越南、印度、中国广西和云南（共计29个，占80.56%），可见供试种质的整体聚类结果与其地理来源基本一致。聚类结果也同时反映了杧果品种（系）的选育历史，爱文来自美国佛罗里达州，其亲本未知，本研究中爱文和印度杧1号之间的相似性系数为1.000，说明二者之间的遗传差异很小，美国佛罗里达州杧果品种多是从印度品种后代选育而来，推测爱文可能是印度杧1号的后代；台农1号是美国海顿和爱文的杂交后代，三者亲缘关系很近，相似性系数分别为0.7838、0.8243、0.8514，一起聚在I-1亚群；乳杧是龙眼香杧的实生后代，二者相似性系数为0.8373，共同聚在I-4亚群，这一结果与罗世杏等[27]的研究结果相同；台湾蜜桃杧是爱文的杂交后代，本研究中二者聚在不同亚群，蜜桃杧与其他来自中国台湾的品种如台农2号、台牙杧、金煌杧、贵妃杧等聚在I-3亚群，爱文与其来源相同的美国品种圣心、红凯特等聚在I-1亚群，出现这一结果的原因可能是杧果在长期开放授粉和自然选择的条件下，培育的新品种在很好适应各个育种地自然条件的同时，也拥有了相似的遗传基础，因而形成了因地而异的品种群[28]。

分子身份证是在DNA指纹图谱的基础上提出的一个概念，即将指纹图谱进行编码赋值，可以更加简单明了地识别和检索种质资源，是鉴定种质资源的一种方法。目前，果树种质资源的分子身份证研究较少[29-31]，关于杧果分子身份证研究仅见2项，即王明等[16]利用7对SSR引物产生的指纹图谱信息区分30个杧果品种，每一对引物可平均区分4.28个品种；姚全胜等[17]以4对核心SSR引物指纹图谱鉴别11个杧果品种，每一对引物可平均区分2.75个品种。TP-M13-SSR是近年发展起来的最新检测技术，结合了SSR技术和荧光检测技术的特点，具有高检测精度、高效率等优点，前人研究表明该技术比目前广泛采用的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测技术准确性更高、重复性更好、效率更高[32-34]。本研究利用12对SSR荧光引物对145份材料进行扩增获得指纹图谱，采用数字和字母相结合的编码方式获得分子身份证，通过分子身份证进行种质鉴定，每一对引物可平均区分12.4份种质，鉴定率明显高于王明和姚全胜，由此可见荧光SSR引物在杧果种质鉴定上更具优势。