多发性骨髓瘤患者化疗序贯CIK细胞输注前后MRD的监测

梁艳艳　郝云良

【摘要】目的：评价细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer，CIK）治疗多发性骨髓瘤（MM）患者的临床疗效。方法：回顾性分析35例化疗治疗后达CR的MM患者，包括序贯免疫治疗组（A组）20例，非序贯免疫治疗组（B组）15例。应用多参数流式细胞仪（FCM）以骨髓瘤细胞（MC）特异分化抗原为标志检测患者骨髓微小残留病灶（MRD），观察A组CIK细胞输注治疗前后MRD的变化，CIK治疗结束后每3个月行MRD监测，B组为对照组，获CR后每3个月行MRD监测，并随访观察两组之间MRD变化的差别。结果：A组患者CIK治疗结束后MRD转阴率为30%，B组患者随访中无1例转阴；A、B组患者治疗结束后半年及1年时MRD复发率比较有统计学意义（P<0.05）。A组中不同CIK疗程患者的半年及1年时MRD复发率比较有统计学意义（P<0.05）。结论：MM患者应用CIK治疗具有明显清除MRD的作用，且多疗程治疗效果更显著，具有延缓复发的作用，且临床应用安全。

【关键词】多发性骨髓瘤；流式细胞术；CIK治疗；微小残留病灶

多发性骨髓瘤（MM）是B细胞起源的骨髓克隆性浆细胞恶性增生和异常积累，并伴单克隆免疫球蛋白增多为特征的一种衰竭性、不可治愈的恶性疾病[1]。微小残留病（MRD）是指经治疗获得完全缓解（CR）后体内残留少量血液肿瘤细胞的状态，被认为是疾病进展和复发的根源[2]。近些年，随着流式细胞术的快速发展，它已经成为MM诊断、鉴别诊断和分型的重要依据[3]，并可通过流式细胞仪对MM患者骨髓细胞进行微小残留病灶（MRD）监测，指导治疗及预后[4]。

资料与方法

研究对象：2010年9月～2013年5月在济宁市第一人民医院及菏泽市市立人民医院确诊并经VAD/PD方案化疗或联合自体造血干细胞移植治疗后达CR的MM患者35例，诊断依据均符合《血液病诊断及疗效标准》。其中男22例，女13例，平均年龄50～75岁，平均年龄62岁，标本均为患者骨髓。随访时间6～38个月，平均时间19个月。

研究方法：CIK治疗：A组患者于化疗结束达CR后采集外周血，所分离的PBMNC在体外进行细胞诱导并培养，于第15天时回输给患者，每次回输细胞（2.5～5.0）×10-9个（内毒素和无菌检测依据《中华人民共和国药典》2005版）。回输时将细胞离心洗涤，于100ml生理盐水重悬后静滴，静滴前给予异丙嗪25mg肌注，并于2h内静脉滴注结束，观察其不良反应。半个月后重复上述过程，大约1个月行1次CIK治疗，1～5个疗程不等。

仪器与试剂：流式荧光单抗、溶血剂购自美国BD公司。流式细胞仪为BD FACSCalibur，流式分析软件为FCS Express4.0。

MRD监测：采用活细胞直接免疫荧光标记的四参数流式细胞术（FCM，BD，USA），利用CD45/SSC设门采集细胞，FCS Express4.0分析软件分析多发性骨髓瘤患者骨髓各群细胞CD45、CD38、CD56、CD19、CD138及CD28、CD117等表达，膜抗原≥20%为阳性，进行MRD监测。以骨髓瘤相关免疫表型（MAIP+）细胞比例≥0.0001且<0.05为MRD阳性；MAIP+细胞（MC）<0.0001为MRD阴性。FCM检测发现MAIP+细胞（MC）≥0.05为复发诊断标准。

MRD随访：A组于CIK治疗结束后及B组化疗结束后开始随访，至MRD复发随访结束，未复发者随访至今，随访时间3～38个月，平均16个月。

CIK治疗不良反应：治疗期间持续观察患者的体温、呼吸、脉搏及血压生命体征情况。不良事件根据CTCEA（Common Terminology Criteria for Adverse Events）3.0版记录。

统计学处理：应用SPSS 18.0统计软件进行分析。观察A组中≤2疗程（A1）及>2个疗程CIK治疗组（A2）及B组之间的MRD差别，分为MRD转阴、持续阳性及复发三种情况。应用卡方检验和秩和检验，比较各组之间的差别，P<0.05表示差异有统计学意义。

结果

A组患者经化疗达CR后，仍有18例（90%）患者应用FCM能检测到≥1.0×104的MRD，B组均能检测到≥1.0×104的MRD，其余患者MRD值（0.3～4.2）×102，差异很大。A组经给予CIK治疗（1～5个疗程）后，MRD水平可明显下降，且有6例（30%）患者MRD转阴，且随着CIK疗程数的增加，随访中发现≤2疗程CIK治疗组（A1）和>2个疗程CIK组（A2）半年及1年时MRD复发率比较有统计学意义（P<0.05）。B组患者随访中无1例转阴。A、B组患者治疗结束后半年及1年时MRD复发率比较有统计学意义（P<0.05）。

不良反应：CIK治疗组有4例（20%）患者在回输后出现一过性轻微畏寒、低热，经给予对症处理后症状消失，且未再反复。

讨论

多发性骨髓是血液系统常见的恶性肿瘤，常规化疗缓解率低，虽然新一代药物硼替佐米、雷利度胺等的应用及大剂量化疗联合造血干细胞移植取得了较大成效，但仍面临复发的风险。究其原因是化疗尚无法彻底清除瘤细胞，微小残留病灶（MRD）使MC容易复发和转移，并诱发耐药。目前，如何能巩固已经获得CR的MM患者的疗效，降低复发风险，以期获得长期无病生存，甚至治愈，已成为众多学者研究的问题。

近年来，过继细胞免疫治疗发展迅速，其中CIK治疗已成为热点，但若单独临床应用，疗效并不佳。当前的共识是首先应用化疗将肿瘤负荷降至最低，再选用理想的免疫治疗方案在不增加治疗毒性的基础上产生抗肿瘤免疫反应的协同作用。化疗后序惯治疗或者其他维持治疗能进一步减少MRD，是改善预后的重要策略之一[5]。我们的研究发现，在MM患者经过化疗达CR的基础上，序贯CIK治疗，结果表明能进一步杀灭残存肿瘤细胞，甚至使MRD转阴。

Dworzak等很早就在急性白血病方面研究化疗以后MRD水平是否能降到10-4以下对患者能否长期生存具有重要意义[6]。但对于MM患者而言，由于MC在骨髓中往往呈灶状分布，且MC与正常浆细胞在形态学上容易混淆，灵敏度低，仅能达到5×102水平[7]。血、尿蛋白电泳可间接反映肿瘤负荷量，但特异性较低，敏感度也不高，用来分析MRD亦有一定局限性。目前随着流式细胞术的发展，实现了通过流式细胞仪对MM患者骨髓细胞进行MRD监测，且有利于治疗评估和预后判断，且其意义大于初发诊断[8-9]。目前常用CD138+/CD38+++/CDl9—和CD138+/CD38+++/CD56+的表型检测MM的MRD，该方法最高敏感性可达1.0×10-4水平[10]。无论在任何检测点，只要MC>0.0001，就存在复发的危险。

本研究中A组20例MM患者获CR后经给予序惯CIK（1～5个疗程）治疗，已有6例患者MRD转阴，未能转阴的患者MRD水平亦不同程度下降，B组15例MM患者获CR后，无1例患者MRD转阴，且有明显升高趋势。随着治疗的结束，两组患者MRD均有上升趋势，且部分病例复发。A组CIK治疗结束后与B组化疗结束后，随访观察中发现，随时间延长，两组之间复发率比较有统计学差异。说明CIK治疗不但能进一步清除残存的肿瘤细胞，且随着CIK疗程的增加，疗效更显著，且有延缓复发，甚至治愈可能。刘红伟等研究不同疗程CIK治疗之间的疗效比较时发现多疗程CIK治疗效果优于单疗程CIK治疗的患者[11]，多次CIK治疗延长肿瘤患者生存期，提高生活质量，对肿瘤复发有较好的作用，这与我们的研究结果一致。

本研究结果认为，在MM患者经化疗治疗达CR后应用CIK治疗，可进一步清除MRD，同时还可改善患者免疫状态和生活质量，延缓复发，进一步提高临床治疗效果，为MM患者提供了新的治疗策略。但是MM患者异质性强，参数变量不易统一，这种联合治疗的分子机制及方案配置的优化等问题还需进一步的研究和论证[12]。鉴于CIK治疗具有独特的抗瘤优势和免疫支持作用，而且安全可靠，很可能在未来成为MM患者的根治方法[13]，值得临床应用推广。

参考文献

[1]张之南.血液病诊断及疗效标准[M]第2版.北京：科学出版社，1998：373-379.

[2]Adana AZ，David HV.Multiple myeloma：an old disease with new hope for the future[J].Can Cancer J Clin，2001，51（5）：273-285.

[3]Mateo G，Montalban MA，Vidriales MB，et al.Prognostic Value of immunophenotyping in multiple myeloma：a study by the PETHEMA/GEM cooperative study gropes on patients uniformly treated with high-dose therapy[J].J Clin Oncol，2008，26（16）：2737-2744.

[4]Rawstron AC，Orfao A，Beksac M，et al.Report of the European Myelome Network on multiparametric flow cytometry in multiple myeloma and related disorders[J].Haemotologica，2008，93（3）：431-438.

[5]Haroussean JL，ARM M，Avet-Loiseau.The role of complete response in multiple myeloma.Blood，2009，114：3139-3146.

[6] Dworzak MN，Frosch IG，Printz D，et al.Prognostic significance and modalities of flow cvtometric minimal residual disease detection in childhood acute lymphoblastic leukemia[J].B1ood，2002，99（6）：1952-1958.

[7]Maisnar V，Touskova M，Tichy M，et al.The significance of soluble CD138 in diagnosis of monoclonal aammopathies[J].NEOPLASMA，2006，53（1）：26-29.

[8]朱明清.多参数流式细胞术在多发性骨髓瘤微小残留病灶监测中的应用[J].江苏医药2007，33（8）：778-780.

[9]Gupta R，Bhaskar A，Kumar L，et al.Flow cytometric immunophenotyping and minimal residual disease analysis in multiple myeloma[J].Am J Clin Pathol，2009，132（5）：728-732.

[10]吴冠宇.多参数流式细胞术检测多发性骨髓瘤免疫表型及意义[J].国外医学输血及血液学分册，2005，28（1）：61-63.

[11]刘红伟，孟明耀，等.不同疗程CIK治疗患者的CIK细胞的细胞毒活性研究[J].昆明医学院学报，2010，（12）：37-40.

[12]陈文明，黄晓军，李娟.多发性骨髓瘤：现状与进展[M].北京：人民军医出版社，2010：47-65.

[13]Younes A.Novel treatment strategies for patients with relapsed classical Hodgkin lymphoma[J].Hematology amsoc Hematol Educ Program，2009：507-519.

Dworzak等很早就在急性白血病方面研究化疗以后MRD水平是否能降到10-4以下对患者能否长期生存具有重要意义[6]。但对于MM患者而言，由于MC在骨髓中往往呈灶状分布，且MC与正常浆细胞在形态学上容易混淆，灵敏度低，仅能达到5×102水平[7]。血、尿蛋白电泳可间接反映肿瘤负荷量，但特异性较低，敏感度也不高，用来分析MRD亦有一定局限性。目前随着流式细胞术的发展，实现了通过流式细胞仪对MM患者骨髓细胞进行MRD监测，且有利于治疗评估和预后判断，且其意义大于初发诊断[8-9]。目前常用CD138+/CD38+++/CDl9—和CD138+/CD38+++/CD56+的表型检测MM的MRD，该方法最高敏感性可达1.0×10-4水平[10]。无论在任何检测点，只要MC>0.0001，就存在复发的危险。

本研究中A组20例MM患者获CR后经给予序惯CIK（1～5个疗程）治疗，已有6例患者MRD转阴，未能转阴的患者MRD水平亦不同程度下降，B组15例MM患者获CR后，无1例患者MRD转阴，且有明显升高趋势。随着治疗的结束，两组患者MRD均有上升趋势，且部分病例复发。A组CIK治疗结束后与B组化疗结束后，随访观察中发现，随时间延长，两组之间复发率比较有统计学差异。说明CIK治疗不但能进一步清除残存的肿瘤细胞，且随着CIK疗程的增加，疗效更显著，且有延缓复发，甚至治愈可能。刘红伟等研究不同疗程CIK治疗之间的疗效比较时发现多疗程CIK治疗效果优于单疗程CIK治疗的患者[11]，多次CIK治疗延长肿瘤患者生存期，提高生活质量，对肿瘤复发有较好的作用，这与我们的研究结果一致。

本研究结果认为，在MM患者经化疗治疗达CR后应用CIK治疗，可进一步清除MRD，同时还可改善患者免疫状态和生活质量，延缓复发，进一步提高临床治疗效果，为MM患者提供了新的治疗策略。但是MM患者异质性强，参数变量不易统一，这种联合治疗的分子机制及方案配置的优化等问题还需进一步的研究和论证[12]。鉴于CIK治疗具有独特的抗瘤优势和免疫支持作用，而且安全可靠，很可能在未来成为MM患者的根治方法[13]，值得临床应用推广。

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本研究中A组20例MM患者获CR后经给予序惯CIK（1～5个疗程）治疗，已有6例患者MRD转阴，未能转阴的患者MRD水平亦不同程度下降，B组15例MM患者获CR后，无1例患者MRD转阴，且有明显升高趋势。随着治疗的结束，两组患者MRD均有上升趋势，且部分病例复发。A组CIK治疗结束后与B组化疗结束后，随访观察中发现，随时间延长，两组之间复发率比较有统计学差异。说明CIK治疗不但能进一步清除残存的肿瘤细胞，且随着CIK疗程的增加，疗效更显著，且有延缓复发，甚至治愈可能。刘红伟等研究不同疗程CIK治疗之间的疗效比较时发现多疗程CIK治疗效果优于单疗程CIK治疗的患者[11]，多次CIK治疗延长肿瘤患者生存期，提高生活质量，对肿瘤复发有较好的作用，这与我们的研究结果一致。

本研究结果认为，在MM患者经化疗治疗达CR后应用CIK治疗，可进一步清除MRD，同时还可改善患者免疫状态和生活质量，延缓复发，进一步提高临床治疗效果，为MM患者提供了新的治疗策略。但是MM患者异质性强，参数变量不易统一，这种联合治疗的分子机制及方案配置的优化等问题还需进一步的研究和论证[12]。鉴于CIK治疗具有独特的抗瘤优势和免疫支持作用，而且安全可靠，很可能在未来成为MM患者的根治方法[13]，值得临床应用推广。

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