密度梯度离心法和红细胞裂解法对小鼠外周血淋巴细胞表面分子表达的影响

周扬++钟锐华++唐利波

[摘要] 目的 比较密度梯度离心法和全血红细胞裂解法对小鼠外周血淋巴细胞表面分子表达的影响。方法 采用流式细胞术检测密度梯度离心法和全血红细胞裂解法获得的小鼠外周血存活淋巴细胞比例以及表型分子（CD3、CD4、CD8、CD19和CXCR5）的频数。 结果 密度梯度离心法获得的小鼠外周血存活淋巴细胞比例较全血红细胞裂解法获得的存活淋巴细胞显著升高（92.70% vs 85.90%，P<0.05）。与密度梯度离心法相比，全血红细胞裂解法可使外周血淋巴细胞中CD3、CD4和CD8表达显著下降（60.10% vs 35.90%，P<0.05；42.90% vs 20.30%，P<0.05；24.60% vs 14.80%，P<0.05），而CD19和CXCR5表达则显著升高（12.80% vs 35.30%，P<0.05；15.00% vs 35.10%，P<0.05）。结论 密度梯度离心法获得的小鼠外周血淋巴细胞活力强且表型稳定，可作为分离此类细胞的优选方法。

[关键词] 流式细胞术；小鼠外周血；淋巴细胞；密度梯度离心法；全血红细胞裂解法

[中图分类号] R446 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）05（b）-0031-03

[Abstract] Objective To compare the effect of density gradient centrifugation and red blood cell lysis method on the expression of peripheral blood lymphocytes surface molecules in rats. Methods The frequency of survival lymphocyte ratio and surface molecules （CD3， CD4， CD8， CD19 and CXCR5） in rats were tested by the density gradient centrifugation and red blood cell lysis method. Results The peripheral blood survival lymphocytes ratio tested by the density gradient centrifugation was obviously increased compared with that of red blood cell lysis method （92.70% vs 85.90%，P<0.05）， and the red blood cell lysis method could make the CD3， CD4 and CD8 in the peripheral blood lymphocytes obviously decreased compared with that of density gradient centrifugation （60.10% vs 35.90%， P<0.05； 42.90% vs 20.30%，P<0.05；24.60% vs 14.80%， P<0.05）， but the expressions of CD19 and CXCR5 obviously increased （12.80% vs 35.30%， P<0.05； 15.00% vs 35.10%， P<0.05）. Conclusion The vigor of peripheral blood lymphocytes of rats obtained by the density gradient centrifugation is strong with steady phenotype， which can be used as the preferred method in isolating this type of cells.

[Key words] Flow cytometry； Peripheral blood of rats； Lymphocytes； Density gradient centrifugation； Red blood cell lysis method

小鼠全血樣品制备的质量可影响流式细胞术免疫检测的结果，目前在临床和基础实验研究中广泛应用商品化红细胞裂解液以达到去除红细胞的效果。虽然既往报道商品化红细胞裂解液对小鼠淋巴细胞表面分子表达无影响[1]，但人群中研究显示红细胞裂解液会影响造血干细胞CD34表达[2]。该研究采用密度梯度离心法和全血红细胞裂解法制备小鼠外周血淋巴细胞，通过流式细胞术检测这两种方法获得的淋巴细胞的活力以及表面分子表达频数，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

小鼠淋巴细胞分离液（货号：LTS1092），Live/Dead（货号：L10119），BD Pharm LyseTM溶液（10x，货号：555899）、抗鼠CD3（货号：555275）、抗鼠CD4（货号：553651）、抗鼠CD8-PECY7（货号：552877）、抗鼠CD19（货号：552854）、抗鼠 CXCR5（货号：560615）。

1.2 实验动物

野生型C57 BL/6小鼠（6～8周龄）15只。

1.3 制备小鼠淋巴细胞悬液

小鼠眼眶静脉丛取300 μL肝素钠抗凝血，200 μL用于密度梯度离心法制备细胞悬液，100 μL用红细胞裂解液制备细胞悬液。

1.4 细胞活力检测

取100 μL细胞悬液恒温孵箱培养3 d后，采用Live/Dead染色，流式检测细胞活力。

1.5 细胞免疫表型检测

取1×106 个细胞采用Live/Dead染色后，加入CD3、CD4、CD8、CD19和CXCR5流式抗体，避光孵育30 min，1 mL PBS洗涤后弃上清，100 uL PBS重悬，流式检测。

1.6 统计方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行处理。组间比较采用两独立样本非参数检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 密度梯度离心法获得的淋巴细胞活力较好。

采用AIM-V培养外周血免疫细胞3 d，标记Live/Dead后采用流式检测。结果表明，与密度梯度离心获得的淋巴细胞相比，全血红细胞裂解获得的淋巴细胞活力显著降低（85.90% vs 92.70%，P<0.05），可见红细胞裂解法获得的淋巴细胞活力欠佳，不适宜于体外长期培养，见图1。

2.2 淋巴细胞表面分子表达频数的检测

密度梯度离心法和全血红细胞裂解法获得的淋巴细胞标记CD3、CD4、CD8、CD19以及CXCR5，流式细胞术检测结果显示，与密度梯度离心法相比较，全血红细胞裂解法获得的外周血淋巴细胞CD3、CD4和CD8表达频数显著下降（60.10% vs 35.90%，P<0.05；42.90% vs 20.30%，P<0.05；24.60% vs 14.80%，P<0.05；图2），而CD19和CXCR5表达频数则显著升高（12.80% vs 35.30%，P<0.05；15.00% vs 35.10%，P<0.05；见图2）。

3 讨论

动态检测小鼠外周血淋巴细胞的表型和功能对于了解小鼠体内免疫应答状况具有重要参考价值。小鼠外周血淋巴细胞的检测结果可受抗体类型、圈门策略以及荧光素等因素的影响[3-4]，另外，获得淋巴细胞的分离方法也可对检测结果产生直接影响[5-6]。

细胞亚群的功能检测对于了解体内免疫状态和探讨机制有着重要意义，而细胞活力是检测的先决条件[7-8]。该研究结果显示红细胞裂解液所获得的细胞培养3 d后活细胞比例虽然可维持在80%左右，但较密度梯度离心法所得细胞的活力已明显下降。可见，红细胞裂解液会导致淋巴细胞活力下降，此影响在细胞长期培养时更加明显。红细胞裂解液除了影响淋巴细胞活力，重要的是其会导致淋巴细胞亚群比例偏倚，表现为T细胞亚群比例下降而B细胞亚群比例升高。该研究中使用红细胞裂解液获得的小鼠外周血淋巴细胞CD3、CD4和CD8分子表达中位数分别为35.90%、20.30%以及14.80%，和既往研究相一致[1]。虽然此试剂不含有固定剂成分，但其在裂解红细胞同时可能也会干扰淋巴细胞表面分子的表达，因此细胞亚群表达比例失调将会对免疫分析产生不可忽视的影响。相对而言，小鼠淋巴细胞分离液获取的外周血淋巴细胞是应用密度梯度离心法，此方法获得的淋巴细胞表面抗原表达受外源性物质干扰较小，更能真实反映各个细胞亚群的特点。

综上所述，该研究认为小鼠外周血淋巴细胞抗原表达的检测应慎重选择使用红细胞裂解液。密度梯度离心法获得的淋巴细胞长时间体外培养仍具有较强活力且各细胞亚群表型稳定，密度梯度离心法可作为小鼠外周血淋巴细胞分离的优选方法应用于实验研究。

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（收稿日期：2017-02-09）