不明原因反复流产患者外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞的变化

马超++冯文华

[摘要]目的 探讨原因不明反复流产（URSA）患者外周血中T淋巴细胞亚群和NK细胞的变化。方法 选取2014年3月～2016年3月辽宁省计划生育科研院附属医院门诊确诊为不明原因流产患者50例作为观察组，并选取同期就诊的30例健康早孕妇女作为对照组。采用流式细胞仪检测两组妇女的外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞水平。结果 观察组外周血中CD4+和CD4+/CD8+比率明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），而两组CD3+和CD8+比率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。观察组外周血中NK细胞比率也明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 URSA患者外周血中CD4+、CD4+/CD8+和NK细胞比率的升高，打破了正常的妊娠免疫微环境而引发流产。

[关键词]原因不明反复流产；T淋巴细胞亚群；自然杀伤细胞；流式细胞术

[中图分类号] R714.21 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）04（a）-0087-03

Molecular Genetics Laboratory，Liaoning Province Research Institute of Family Planning，Shenyang 110031，China

[Abstract]Objective To explore the changes of T lymphocytes sub-types and NK cells in patients with unexplained recurrent abortion.Methods The patients were collected in the Liaoning Province Research Institute of Family Planning from March 2014 to March 2016. The 50 patients with URSA were selected as the observation group and 30 patients with voluntary abortion were selected as the control group.Flow cytometry was used to measure the number of T lymphocytes sub-types and NK cells in the two groups.Results The percentages of CD4+ and ratio of CD4+/CD8+ was significantly increased in peripheral blood of unexplained recurrent abortion patients （P<0.05），while there was no significantly differences in CD3+ and CD8+ （P>0.05）.The level of NK cell was also significantly increased in peripheral blood of unexplained recurrent patients（P<0.05）.Conclusion The increasing level of CD4+，CD4+/CD8+ and NK cells in peripheral blood of recurrent abortion patients is harmful to maintain pregnancy even induced abortion.

[Key words]Unexplained recurrent abortion；T lymphocytes sub-types；NK cells；Flow cytometry

反复自然流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指连续发生了2次或2次以上的自然流产，是一种常见的妊娠并发症[1]。其主要原因有染色体异常、感染、内分泌失调和凝血异常，而排除这些因素后，其中有40%～80%的患者原因不明，称为不明原因反复自然流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[2]。正常妊娠需要母体建立起一个对胎儿局部免疫耐受的环境，如果免疫微环境失调则会导致流产的发生[3]。URSA是育龄妇女常见的妊娠并发症，已经成为困扰育龄妇女和临床工作者的一大难题，其发病机制目前尚不清楚。免疫因素在维持正常妊娠起着关键作用，T淋巴细胞亚群及自然杀伤细胞（natural killer，NK）在妊娠免疫中越来越受到重视，本研究通过比较URSA患者与健康早孕妇女外周血中T淋巴細胞亚群和NK细胞比率，探讨URSA患者外周血中免疫细胞的变化，同时为URSA患者治疗提供理论依据，避免流产的发生。

1资料与方法

1.1一般资料

选择2014年3月～2016年3月于辽宁省计划生育科研院附属医院门诊诊断为URSA患者50例，同期健康早期妊娠并且自愿要求人工流产的患者30例。观察组50例URSA患者平均年龄（30.12±6.73）岁，平均孕龄（8.01±3.13）周，平均月经周期（28.32±3.22）d，平均体重指数（23.27±3.15）kg/m2。对照组30例早孕妇女中，平均年龄（29.42±5.58）岁，平均孕龄（8.32±3.45）周，平均月经周期（29.01±4.73）d，平均体重指数（23.24±3.14）kg/m2。两组患者的年龄、孕龄、月经周期和体重指数等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。所有患者在组织收集前均签署知情同意书并经辽宁省计划生育科研院医学伦理委员会通过。观察组纳入标准：①符合URSA诊断标准：有2次或2次以上的自然流产病史，夫妇双方染色体正常；②内分泌功能正常；③母儿血型不和，抗心磷抗体、抗核抗体均为阴性；④丈夫男科检查均正常。排除标准：合并生殖道感染、畸形。对照组排除标准：①既往有流产史；②合并内分泌、染色体和自身免疫抗体异常；③合并生殖道感染、畸形。

1.2方法

淋巴细胞亚群检测1.2号管均加入女方全血50 μl，然后于1号管中加入10 μl FITC-CD3/PE-CD8/PerCP-CD45/APC-CD4混合单克隆荧光抗体（BD公司；批号：340503），2号管加入10 μl FITC-CD3/PE-CD16+ CD56/PerCP-CD45/APC-CD19混合单克隆荧光抗体（BD公司；批号：340503），振荡混匀，室温避光20 min；加入红细胞裂解液（BD公司；批号：5154719）1 ml，震荡混匀，室温避光10 min；磷酸盐缓冲液洗1次，500 μl悬液上样检测。

1.3统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验和检验分析；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 两组T淋巴细胞亚群及CD4+/CD8+比率的比较

URSA患者外周血中CD4+细胞百分率和CD4+/CD8+比率明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；两组CD3+和CD8+细胞的百分率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 两组NK细胞百分率的比较

URSA患者外周血中NK细胞的百分率为（18.09±2.32）%，明显高于对照组的（14.36±3.21）%，差异有统计学意义（P<0.05）。

3讨论

妊娠是一个复杂的生理过程，是一个特殊的半同种异体移植过程，主要是母体免疫耐受来维持正常妊娠过程，一但母体与胎儿的免疫平衡被破坏，会造成病理性流产的发生[4-5]。各种免疫的失衡均可导致URSA：封闭抗体的缺乏、T淋巴细胞亚群的改变、CD4+/CD8+失衡、Th1/Th2失衡、CD56+CD16+/CD56+CD16-NK细胞亚群比例失调、细胞因子、趋化因子等表达异常[6-8]。

近年来研究发现，URSA的患者多是免疫状态相对异常，其中T淋巴细胞、NK细胞越来越受到关注。胎儿对于母体而言，属于同种异体移植物，其抗原不是存在于母体中枢免疫器官内，妊娠免疫耐受本质主要是外周免疫耐受。根据T淋巴细胞表面的特征性分子不同，可将成熟T细胞分为两个亚群，即CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞。CD4+T淋巴细胞可辅助B淋巴细胞转化为淋巴母细胞而产生抗体，CD8+T淋巴细胞抑制这一过程使CD4+T淋巴细胞的作用不至于过强，两者比例的平衡是维持生理功能正常和免疫反应正常应答的基础。URSA与母体的免疫状态有很大的相关性，反复流产患者表现为免疫系统呈现免疫过度表达的状态。本研究发现，URSA患者外周中CD4+和CD4+/CD8+比率明显高于正常早孕的妇女，这与以往的研究相符[9-10]。CD4+T淋巴细胞为辅助性T淋巴细胞，其比率升高，使机体免疫功能增强，对胚胎的免疫排斥加强，导致妊娠不能继续[11]。正常早孕的妇女外周血中CD4+T淋巴细胞明显低于非怀孕的健康妇女，说明CD4+T淋巴细胞在外周血中表达降低，是正常妊娠维持的一个必要条件。正常妊娠早期，CD4+/CD8+的比值降低，有利于胚胎免于遭受母体免疫系统的排斥。CD4+/CD8+的比值在正常情况下始终保持着动态平衡，当二者比例失调，则会引起免疫紊乱，造成流产的发生。在URSA患者外周中CD4+/CD8+的比值升高，提示早期流产患者淋巴细胞亚群失调，细胞免疫功能过度，导致妊娠不能继续。当URSA经过主动免疫治疗后，CD4+/CD8+的比值下降，利于妊娠的维持[12]。

NK细胞存在于先天性免疫系统的一类淋巴细胞，主要分布于外周血中，不需要预先致敏就能杀伤靶细胞，能产生细胞毒效应。NK细胞在妊娠的维持过程中具有重要作用。在胚胎植入和妊娠早期，子宫蜕膜细胞中NK细胞的比例占70%以上，主要对胎儿滋养层细胞产生免疫耐受作用，提供主要的免疫防御作用。子宫蜕膜中的NK细胞与胚胎滋养细胞直接接触，当其细胞活性过度表达会对胚胎的发育有害，从而引起胚胎损伤乃至流产的发生。目前国内外研究认为CD56+CD16+T细胞等NK细胞与URSA发病机制密切相关[13-14]，外周血高水平的NK细胞预示着染色体核型正常的妊娠可能发生生化妊娠或自然流产[15]。本研究发现URSA患者相比较正常早孕妇女的外周血中NK细胞比率明显升高，提示NK细胞参与了URSA的形成。NK细胞可能发挥作用的机制是NK细胞的杀伤功能启动，释放穿孔素及丝氨酸酯酶，导致胚胎的损伤，引发流产。另外URSA患者外周中NK细胞的增多，改变了细胞因子表达，打破了母胎界面Th1/Th2的平衡，也可以引发流产[16]。

综上所述，CD4+、CD4+/CD8+以及NK细胞比率在URSA患者外周血中升高与早期自然流产的发生相关，免疫因素是URSA流产的重要原因，笔者以T淋巴细胞亚群和NK细胞为研究URSA疾病的切入点，取得一定的结果，对临床URSA的诊疗具有理论意义和指导价值。

[参考文献]

[1]张华坤，刘庆芝，谢建生，等.封闭抗体缺失与不同类型复发性自然流产关系分析[J].實用妇产科杂志，2015，31（10）：787-789.

[2]丛林，刘长明，朱立新，等.原因不明复发性患者淋巴细胞主动免疫前后亚群的变化[J].中国实用妇科与产科杂志，2012，28（5）：378-380.

[3]Chen JL，Yang JM，Huang YZ，et al.Clinical observation of lymphocyte active immunotherapy in 380 patients with unex？鄄plained recurrent spontaneous abortion[J].Int Immunopharmacol，2016，40：347-350.

[4]吴梦茹，朱玥洁，丁剑冰，等.不明原因自发流产与免疫细胞失衡的关系[J].细胞与分子免疫学杂志，2015，31（8）：1144-1147.

[5]张艳霞，高天畅，李梅清，等.不明原因反复自然流产妇女蜕膜中树突状细胞亚群的变化[J].重庆医学，2015，44（16）：2164-2166.

[6]李晓荣，魏丽娜，王海燕，等.主动免疫治疗对URSA患者CD细胞封闭效率及妊娠结局的影响[J].中国卫生检验杂志，2013，23（9）：2102-2104.

[7]周仕华.复发性流产患者T、B淋巴细胞亚群及Th1/Th2指标的变化[J].海南医学院学报，2016，22（7）：686-688.

[8]顾艳，张慧琴.趋化因子及其受体与复发性流产[J].生殖与避孕，2014，34（7）：551-554.

[9]谭秀梅.反复流产患者外周血T淋巴细胞亚群水平变化研究[J].医学检验，2011，18（20）：83.

[10]胡道琴，梁宝珠，陈敏，等.复发性流产患者主动免疫治疗前后T淋巴细胞亚群的变化[J].中国优生与遗传杂志，2013，21（6）：76.

[11]张菱，宫美轩，张亚杰，等.早期自然流产病人外周血T淋巴细胞亚群的检测[J].齐鲁医学杂志，2005，20（4）：324-326.

[12]华月琴，陈瑞华，吴志南，等.主动免疫治疗原因不明习惯性流产后外周血免疫球蛋白及淋巴细胞亚群的变化[J].中国妇幼保健，2010，25（19）：2697-2698.

[13]Hosseini S，Zarneni AH，Asgarian-Omran H，et al.Comparative analysis of NK cell subsets in menstrual and peripheral blood of patients with unexplained recurrent spontaneous abortion and fertile subjects[J].J Reprod Immunol，2014，103：9-17.

[14]司斯.不明原因復发性流产患者外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞特征分析[J].临床军医杂志，2016，44（6）：634-636.

[15]Holmes MA，Li P，Peterdorf EW，et al.Structural studies of allelic diversity of the MHC class I homolog MIC-B，a stress-inducible ligand for the activating immunoreceptor NKG2D[J].Immunol，2002，169（3）：1395-1400.

[16]方志红，刘华.T淋巴细胞亚群、NK细胞及Th1/Th2细胞因子与先兆流产发病的关系[J].江苏医药，2014，40（9）：1070-1071.

（收稿日期：2017-02-12 本文编辑：任 念）