血小板微颗粒的促凝功能与流式细胞术绝对计数值的相关性

饶冬东　张福辉　薛晓光等

[摘要] 目的 探讨流式细胞术所获得血小板微颗粒计数与其功能间的关系。 方法 选取本院2012年9月～2014年9月的100例健康孕产妇及患有合并症孕产妇患者的血液样本作为研究对象，经流式细胞术计数分析及三种功能分析，探讨其相关性。 结果 流式细胞术获得的乳黏素蛋白促凝血的微粒体计数与Zymuphen MP活性呈弱相关（r=0.5370，P<0.01）；与内在凝血酶潜力ETP呈正相关（r=0.7444，P<0.01）；与STA磷脂（PPL）促凝分析呈负相关（r=-0.7872，P<0.01）。膜联蛋白V+及促凝血的血小板源性微颗粒的含量水平与功能分析一致。 结论 血小板微颗粒的促凝功能与流式细胞术绝对计数值密切相关，多参数的使用将会提供更多的生物学信息。

[关键词] 流式细胞术；血小板；源性微颗粒

[中图分类号] R331.1+43 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）05（c）-0114-03

[Abstract] Objective To explore the relationship between the number of platelet-derived microvesicle sorted by flow cytometry cell sorting and their function. Methods 100 copies of blood samplesobtained from healthy maternal women or maternal women with complications from September 2012 to September 2014 in our hospital were selected as the research object.The number of platelet microvesicles were calculated by flow cytometry cell sorting，and their functions were recorded by three function analysis.Their relationship was explored. Results The number of platelet microvesicles was slightly correlated with Zymuphen MP activity （r=0.5370，P<0.01） and positively correlated with ETP （r=0.7444，P<0.01），while negatively correlated with STA PPL （r=-0.7872，P<0.01）.Membrane associated protein V+ was related to the number of coagulation of platelet microvesicles，which was helpful for function analysis. Conclusion The coagulation of platelet microvesicles is closely related to their number counted by flow cytometry cell sorting and the application of multiple parameters will provide valuable biological information.

[Key words] Flow cytometry cell sorting；Platelet；Derived microvesicles

近年来胞外膜泡逐渐受到细胞生物学及临床研究关注，随着对其形态大小、表型及微粒体（MVs）计数研究的进展，其对机体生理及病理的生物学作用逐渐被了解。流式细胞术是最常采用的微粒体分析技术，其检测的最低范围为0.2～0.5 μm。纳米粒子跟踪分析（NTA）及原子粒显微镜（AFM）技术已证实绝大多数胞外膜泡直径<0.3 μm，提示流式细胞术所能检测到的微粒体可能只是“冰山一角”[1]。新一代的流式细胞术通过改善聚光角度提高了微粒体的分辨率，最小可达0.1 μm，在分散时改变了聚光，增加了检测微小粒子的敏感度[2-3]。高敏感度的流式细胞术拥有较高的FSc分辨率、较低的背景噪声，能够检测的微粒体数目是常规流式细胞术的8～20倍。研究显示，不同临床表现的患者其微粒体大小比例不同，提示微粒体的大小可能包含更多的生物学信息[4]。本研究旨在比较3种现存的检测血小板微颗粒促凝功能的方法，结合流式细胞术获得的血小板微颗粒绝对计数，分析血小板微颗粒的绝对计数与微粒体的功能间是否存在一定的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年9月～2014年9月入住本院的100例孕产妇样本作为研究对象，其中53例无特殊既往病史及服药史，BMI指数在正常范围内，平均BMI指数为22.5。其余47例中，28例（59.6%）患有妊娠期高血压，11例（23.4%）存在高脂血症，8例（17.0%）患有2型糖尿病，平均BMI指数为33.4。提取2.7 ml血液至含有0.3 ml3.2%枸橼酸钠缓冲液的真空采血管中，废弃第一只采血管以避免内皮来源的微粒体干扰。取血15 min内，1550×g、20℃、离心20 min，获得去血小板血浆（PPP），提取离心管上层PPP，迅速于-80℃冰冻，储存12个月。

1.2 流式细胞术分析血小板微颗粒绝对计数

250 μl PPP室温下解冻，样本于18000×g、30 min离心2次，微粒体重新悬浮于100 μl 0.32%枸橼酸PBS中，膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素及FITC乳黏蛋白用于微粒体凝集前染色。0.10 μg/ml的CD31-藻红蛋白及0.013 μg/ml的CD41-藻红蛋白-Cy5用于区分血小板源性的微粒体（PMVs，CD31+CD41+）及内皮源性的微粒体（EMVs，CD31+CD41-）；4.17 μg/ml 的CD144-PE、0.42 μg/ml的CD62E-PE-Cy5及 0.21 μg/ml CD106-PE-Cy5 用于标记EMVs；0.069 μg/ml的血型糖蛋白A（CD235a）-PE用于染色红细胞来源的微粒体；CD45-别藻蓝蛋白0.21 μg/ml作为白细胞来源的微粒体的标志物；0.10 μg/ml的CD66B-FITC用来标记粒细胞源性微粒体；0.42 μg/ml CD-14PE用来标记单核细胞源性微粒体。样本在室温下与合适的单克隆抗体培育30 min，避光，同时添加900 μl PBS构橼酸用于控制膜联蛋白。

1.3 微粒的功能分析

1.3.1 Zymuphen MP ELISA 该Zymuphen ELISA是对PPP中微粒体凝聚活性的功能性分析，磷脂酰丝氨酸（PS）及微粒体连结于微孔板上并暴露其磷脂面，促使促凝血球蛋白复合体将凝血素分成凝血酶，微粒体的磷脂凝集与凝血酶的产生直接相关。PPP样本及控制盒经钙、Ⅹa因子（FⅩa）及凝血酶稀释至1∶20，稀释的对照及样本添加至ELISA板中37℃培育1 h。洗板5次，添加100 μl FⅩa-FⅤa及50 ul凝血素，37℃培育10 min；后添加50 μl凝血酶基底物37℃培育3 min；最后添加50 μl终止液，405 nm下读板。

1.3.2 STA磷脂（PPL）促凝分析 通过凝集时间评估微粒体促凝活性。凝结时间取决于样本的促凝磷脂，凝结时间缩短提示促凝磷脂的增加。PPP样本置于STA自动分析仪上分析，利用STA促凝磷脂试剂盒检测。为验证实验的可重复性，采用2个控制盒，样本中促凝磷脂的添加及检测均自动进行， 凝集仅取决于血浆样本中的凝集磷脂水平。

1.3.3 内在凝血酶潜力ETP分析 PRP试剂包含1 pmol/L组织因子（TF）及少量磷脂，被最初添加诱发凝血酶产生，固定时间间隔取出样本，凝血酶的产生有助于样本中促凝微粒体的凝集。80 μl PPP添加至96孔板内，板孔添加20 μl PRP试剂及20 μl凝血酶校准液后，37℃培育置板于Fluoroskan Ascent FL仪器上分析相关荧光强度、滞后时间（min）、最高值时间（min）、最高值时凝血酶产生量（nmol/L）及凝血酶产生曲线下的面积（nmol/L×min）。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以x±s表示，3种分析方法间行Spearman相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血小板微颗粒促凝功能3种方法分析间的相关性分析

Zymuphen ELISA检验PPP结果为（5.72±1.01）%，磷脂促凝分析结果为（5.39±1.21）%，ETP分析-ETP为（4.96±1.75）%，最高值为6.71%。ETP分析中，ETP（nmol/L×min）及最高值（nmol/L）与预期的结果一致，两者间呈正相关（r=0.9852，P<0.01）。Zymuphen MP-ELISA与STA磷脂（PPL）促凝分析结果呈负相关，Zymuphen MP-ELISA与ETP分析及其最高值呈正相关，磷脂促凝分析与ETP分析及其最高值呈负相关（表1）。

2.2 血小板微颗粒促凝功能与血小板微颗粒绝对计数间的相关性

膜联蛋白V+微粒体、乳黏蛋白+微粒体、CD31+CD41+PMVs的平均培养计数分别为41.76±19.43、12.11±2.73、241.96±69.43。Zymuphen MP-ELISA结果分析显示，膜联蛋白V+、乳黏蛋白+及血小板源性的微粒体与流式细胞术结果呈中度正性相关。STA磷脂（PPL）促凝分析结果显示，以上三者与流式细胞术结果呈负相关。ETP分析及其最高值与其呈正相关（表2）。

3 讨论

本研究中，Zymuphen MP-ELISA结果分析与ETP分析及其最高值结果呈弱性正相关，与STA磷脂促凝分析结果呈中度负相关。相对于其他2种方法而言，Zymuphen MP-ELISA与流式细胞术所获得的微粒体绝对数结果也呈中度正相关关系，这与相关研究结果基本一致，相关的因素可能为微小微粒体上的磷酸酰丝氨酸能够被ELISA检测到而被流式细胞术忽略[5-6]。STA磷脂促凝分析结果与ETP分析及其最高值呈负相关，并且与Zymuphen MP-ELISA结果呈中度负相关，磷脂凝集时间的缩短提示样本中促凝磷脂水平的上升；结果同时与血小板源性的促凝微粒体呈显著负相关，提示量化结果与微粒体的凝集潜能相关。ETP分析及其最高值与血小板微颗粒呈正相关，再次验证了微粒体功能与流式细胞量化分析间的相关关系，这与目前的研究结果一致。研究显示，STA磷脂促凝分析与ETP分析相比较于微粒体的磷脂酰丝氨酸浓度能够更好地与流式细胞术所获得的绝对计数一致[7-8]，这可能是由于绝大多数的凝集及凝血酶产生取决于大微粒体，而磷脂酰丝氨酸的产生则主要取决于小微粒体[9-10]。

功能分析能够较好地检测促凝血微粒体彼此关联性，但与其他内皮细胞、淋巴细胞、粒细胞等来源的微粒体则无明显关系[11-12]。功能分析能够检测到更小的微粒体，并且相对快捷和便宜，但是不能给出绝对计数并且无法提供细胞来源信息[13-14]。在本研究中，健康孕产妇和患有合并症的孕产妇间的微粒体功能分析及流式细胞术计数分析存在差异，合并症组BMI更高且相关的合并症接受药物治疗。目前也有研究显示，患有合并症患者拥有更高水平的促凝血血小板微颗粒并且受药物治疗影响[15-17]。

本研究初步证实了流式细胞术获得的血小板微颗粒绝对计数与其促凝功能相一致，多种分析方法的同时使用能够更全面地体现血小板微颗粒在健康与疾患间的生理、病理性作用。

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（收稿日期：2015-01-21 本文编辑：祁海文）