基于转录组测序的斑地锦内参基因筛选及验证

许建丰 桂明明 张永康 尧子钊 黄胜和 饶泽昌

关键词：斑地锦；内参基因；转录组测序；实时荧光定量PCR

斑地锦（EuphorbiamaculataL.）是一年生大戟科（Euphorbiaceae）大戟属（EuphorbiaL.）草本植物，分布于江西、新疆、河南和浙江等地区[1]，具有清热解毒功效，主治痢疾、泄泻、尿血、便血、疮疖痈肿、湿热黄疸等[2]。斑地锦主要含有黄酮类、萜类、酚酸类和生物碱类等成分，目前已开发有肠炎宁片、三七止血片、泻痢宁片等中成药，其主要药效成分之一为黄酮类物质槲皮素[3]，研究槲皮素等药用植物有效成分生物合成途径基因及其调控已成为热点之一[4]。

实时荧光定量PCR（RT-qPCR）是分子生物学中研究基因表达的重要工具之一，具有定量准确、特异性强、灵敏度高、重复性好等优点，常用于基因表达定量分析[5]。然而，合适的内参基因是获得可信相对定量结果的前提[6]。研究表明，不经筛选评价而以一种基因作为任何条件下的内参基因可能会大大降低结果的精确度[7-8]。基因芯片及转录组测序技术等已被用于筛选传统的或新的内参基因，以利于RT-qPCR的开展[9]。转录组测序是对某一物种的mRNA进行高通量测序，反映特定条件或特定时间点的基因表达情况，通过分析转录组测序结果可以初步筛选出候选内参基因[10]。目前评价内参基因表达稳定性的软件较多，其中应用较广泛的有geNorm、NormFinder和BestKeeper[11-12]。为筛选适用于斑地锦不同生长期不同组织RT-qPCR检测的内参基因，本研究以前期筛选出的内参基因EmUBQ[13]和通过转录组测序数据初步筛选出的9个表达相对稳定的基因EmRSZ21、EmSE、EmTRI1、EmGDI1、EmSYP22、EmLSM12、EmGBP、EmRPL7、EmUBC为候选内参基因进行RT-qPCR，分析其在营养生长期和生殖生长期的根、茎、叶、果中的表达模式，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper等软件综合分析其表达稳定性排名，并用EmC4H（槲皮素生物合成过程中的关键酶基因之一）进行验证，为斑地锦不同生长期基因组织特异性表达研究提供可靠的内参基因。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料供试材料采自江西中医药高等专科学校实验田，经其药学系中药教研室鉴定为斑地锦。分别采集营养生长期（未开花且地上部分有2个及以上分枝）植株的根、茎、叶和生殖生长期（结3个及以上的果）植株的根、茎、叶、果，7种样品皆为来源于3株以上植株的混合样，样品采集后立即置于-80℃冰箱备用。

1.1.2主要试剂与仪器RNA提取试剂盒（SpinColumnPlantTotalRNAPurificationKit）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；反转录试剂盒（PrimeScriptTMRTReagentKitwithgDNAEraser）、荧光定量PCR试剂（PrimeScriptTMRTMasterMix）、Pfu酶（TransStartFastPfuDNAPolymerase）、Taq酶等购自宝生物工程（大连）有限公司。普通PCR仪（T100TMThermalCycler）、荧光定量PCR仪（CFX96Real-Time）等购自美国Bio-Rad公司。超微量分光光度计（NanoDropOne）购自美国ThermoScientific公司。引物合成、测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2方法1.2.1总RNA的提取和cDNA的合成参照试剂盒说明书，提取斑地锦不同生长期根、茎、叶、果总RNA，通过超微量分光光度计测定RNA浓度，并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。cDNA的合成按相应试剂盒说明书进行操作。

1.2.2候选内参基因的筛选根据课题组斑地锦转录组测序结果，选取FPKM值大于10且变异系数小于0.1的9个基因EmSE、EmUBC、EmGDI1、EmLSM12、EmGBP、EmSYP22、EmTRI1、EmRSZ21、EmRPL7以及课题组前期筛选的EmUBQ共10个基因为候选基因。

1.2.3引物设计及特异性检测利用PrimerPremier5.0软件设计9个候选内参基因及EmC4H基因定量PCR引物，EmUBQ定量PCR引物参考文献[13]，各引物序列见表1。为排除引物二聚体，检验引物特异性及非特異性扩增产物对结果的影响，用相应引物进行普通PCR扩增。

1.2.4RT-qPCR溶解曲线分析以cDNA作为模板，进行RT-qPCR扩增，加热RT-qPCR产物从65℃到95℃，每隔0.5℃停留5s检测1次荧光强度以获得溶解曲线。RT-qPCR反应体系（25μL）：2×TBGreenPremixExTaqII12.5μL，上游引物、下游引物各1μL（10μmol/L），cDNA溶液2μL，灭菌ddH2O8.5μL。扩增程序：95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃30s，40个循环。

1.2.5候选内参基因的筛选分别将各样品总RNA的反转录产物cDNA作为模板，以各定量PCR引物进行RT-qPCR扩增。将Ct值按公式Q=E（minCt-sampleCt）（E为扩增效率，默认值为2；minCt为基因在各样品中的最小Ct值；sampleCt为基因在某样品中的Ct值）进行计算，Q值导入geNorm和NormFinder软件中进行稳定性分析。将各样品得到的Ct值输入BestKeeper软件中，得到候选内参基因的表达稳定性变异系数（CV）和标准差（SD）。最后运用几何平均值算法进行综合排名，得出最适合斑地锦不同生长期基因组织特异性表达研究的内参基因。

1.2.6内参基因稳定性验证以综合分析排名表达稳定性最优的基因为内参基因，对槲皮素生物合成过程中的EmC4H基因的表达情况进行分析，RT-qPCR方法参照1.2.4，结合EmC4H基因的转录组数据，对内参基因进行表达稳定性验证。

2结果与分析

2.1RNA提取与质量检测

所有样品总RNA的OD260/OD280及OD260/OD230值，利用Nanodrop检测均在2.0左右，说明所提取RNA纯度较好。所有RNA样品经1%琼脂糖凝胶电泳检测显示28S和18S条带明显（图1），说明总RNA完整性较好，均可用于后续试验。

2.2内参基因引物的特异性与熔解曲线分析

内参基因引物PCR扩增出单一且较亮的条带，条带大小与预期相符，无引物二聚体（图2），引物特异性强，可用于后续检测分析。对10个候选内参基因在不同时期各个样品的RT-qPCR分析表明，各基因Ct值均在22～31之间，各基因引物的熔解曲线均显示单峰（图3），表明RT-qPCR所用引物可与模板cDNA特异性结合并扩增靶基因。

2.3候选内参基因表达稳定性分析

2.3.1候选内参基因的表达丰度分析10个候选内参基因中，EmRSZ21的平均Ct值最大，为28.82，说明该基因的表达丰度最低；EmUBQ的平均Ct值最小，为22.26，说明该基因的表达丰度最高。10个候选内参基因的平均Ct值利用Excel中的t检验分析显著性差异，表达丰度排序依次是EmUBQ>EmGBP=EmGDI1>EmTRI1=EmRPL7=EmUBC>EmLSM12=EmSE>EmSYP22>EmRSZ21（图4）。

2.3.2geNorm软件分析geNorm软件通过计算稳定系数M，以确定表达最稳定的内参基因。该软件以M=1.5作为临界点，M值越小，稳定性越好。10个候选内参基因在不同组织中表达的M值均小于1.5，稳定性排名为EmSE>EmUBC>EmGDI1>EmLSM12>EmUBQ>EmGBP>EmSYP22>EmTRI1>EmRSZ21>EmRPL7（表2）。

2.3.3NormFinder软件分析NormFinder软件与geNorm类似，也是基于各候选内参基因的M，通过方差评估其表達稳定性。NormFinder分析结果显示，10个候选内参基因在各组织中的表达稳定程度存在差异，按M值大小排序依次为EmGDI1>EmUBQ>EmUBC>EmSYP22>EmSE>EmRPL7>EmLSM12>EmGBP>EmTRI1>EmRSZ21（表3）。

2.3.4BestKeeper软件分析BestKeeper软件直接根据各基因的Ct值，通过计算变异系数（CV）和标准偏差（SD）来评估各内参基因的稳定性，且CV和SD值与基因的稳定性呈负相关，即稳定的内参基因具有较小的CV值和SD的值。BestKeeper分析结果显示，10个候选内参基因的SD值只有EmUBQ和EmGDI1小于1.0（默认阈值）（表4）。

2.3.5综合性分析BestKeeper分析结果与geNorm和NormFinder软件分析结果差异明显，采用几何平均值算法进行各候选内参基因的综合排名，内参基因稳定性越好则几何平均值越低。10个候选内参基因在斑地锦不同生长期的不同组织中表达稳定性综合排名为EmGDI1>EmUBQ>EmSE>EmUBC>EmLSM12=EmGBP>EmTRI1>EmSYP22>EmRSZ21=EmRPL7（表5）。

2.4内参基因稳定性验证

以EmGDI1为内参基因，分析槲皮素生物合成过程中关键基因之一EmC4H的表达量差异，以验证软件分析结果的可靠性。结果表明，以EmGDI1为内参基因，EmC4H在营养生长期的表达差异与转录组测序结果趋势完全一致，在生殖生长期的表达差异与转录组测序结果趋势基本一致（图5）。因此，使用EmGDI1基因为内参基因，能够较为准确地校准斑地锦不同生长期不同组织中的RT-qPCR检测结果。

3讨论

随着药用植物分子生物学研究的不断深入，药用活性成分生物合成的关键酶基因表达与调控逐渐成为研究热点。荧光实时定量PCR是检测基因表达模式的高效手段之一，而具有合适、稳定的内参基因是荧光实时定量PCR的基础。Act、GAPDH、UBQ、18SrRNA等传统内参基因被广泛应用，但在不同组织、不同生长期以及不同处理条件下均稳定表达的内参基因并不存在[7]，因此需要根据试验条件的改变筛选出可靠的内参基因，或应用内参基因组合以减少基因表达误差[14]。基于转录组测序的RT-qPCR内参基因筛选是近年来发展的一个新的有效策略，在酿酒酵母中已筛选鉴定出一套全新的内参基因[15]，也已成功应用于一些丝状真菌、植物和动物中[16-18]，例如在马尔尼菲青霉菌中，Actin基因在不同细胞类型中表达最稳定[19]，而基于转录组测序获得的FacpA和DigA基因在双相转换过程中表达稳定性最高[20]。本研究根据斑地锦转录组测序结果，筛选出EmSE、EmUBC、EmGDI1、EmLSM12、EmGBP、EmSYP22、EmTRI1、EmRSZ21、EmRPL7和课题组前期利用同源克隆法获得的内参基因EmUBQ，共10个候选内参基因进行RT-qPCR，分别用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件评价其在各生长期（营养生长期、生殖生长期）根、茎、叶和果中的表达稳定性。结果显示，不同软件对10个内参基因表达稳定性的评估并不完全一致。EmUBQ在BestKeeper评价时表达最稳定，而在geNorm和NormFinder评估中排序居中；EmSE在geNorm中排序最好，而在其他2种软件中排序较差。这种现象在地菍（Melastomadodecandrum）[21]、扇脉杓兰（Cypripediumjaponicum）[22]和阳桃（Averrhoacarambola）[23]等研究中也存在，可能是由于软件的算法不同导致内参基因稳定性排序不同[24]。因此，需要几何平均值算法进行综合分析得到最适合的内参基因。同时，为了验证筛选出的内参基因表达稳定性，选取槲皮素生物合成过程中的关键基因EmC4H作为目的基因进行了验证，结果表明，以综合分析结果最好的EmGDI1为内参基因，EmC4H在斑地锦不同生长期各组织中的表达差异与转录组测序结果趋势一致[25]，进一步证明EmGDI1内参基因的可靠性。

GDI1是GDP解离抑制因子，属于Rab蛋白家族，普遍表达在各种组织中，能与RabGTPase结合在膜上，参与调节囊泡形成、囊泡沿着微管和微丝运输以及膜融合等多个方面的膜运输过程。在甘蓝型油菜新开发的内参基因中，GDI1也是最稳定的内参基因之一[26]。10个候选内参基因中，EmUBQ表达也较稳定，仅次于EmGDI1，如果采取内参基因组合，则EmGDI1和EmUBQ较为合适。但是若试验情况发生了变化，例如研究光照条件对斑地锦基因表达的影响等，可能需要重新筛选评估以获得合适的内参基因。

本研究根据课题组前期研究及转录组测序数据筛选出10个候选基因，结合RT-qPCR技术及geNorm、NormFinder和BestKeeper等内参基因分析软件对各候选基因进行稳定性分析，以槲皮素生物合成过程中的EmC4H基因进一步验证，确定EmGDI1为较适合斑地锦不同生长期不同组织基因表达模式研究的内参基因，为斑地锦分子生物学研究提供了便利条件。