轮叶党参多糖的分离纯化及结构研究

刘艳秋 王亚茹 毛迪锐 常 凯

(北华大学林学院,吉林 吉林 132013)

轮叶党参(CodonopsislanceolataBenth. et. Hook. f)又称山胡萝卜、北沙参等,为桔梗科党参属多年生缠绕性藤本植物。主要分布在中国东北、华北和华东地区以及朝鲜、日本和俄罗斯等地[1]。轮叶党参多生长在沟边、灌木林下或阔叶林内,主要食用部位为根,具有较高的营养价值[2-3]。随着科技的进步,轮叶党活性成分的研究已经取得了一定进展,当前对轮叶党参功能性成分研究主要集中在皂苷、黄酮和生物碱类物质,具有降血脂、降胆固醇、减肥、调节胃肠道和改善记忆等作用[4-6]。

多糖是由若干个单糖分子由端基碳原子连接形成的高分子化合物,分子结构含有多种苷键类型[7-8],具有广泛的生物活性,是开发药物、功能性食品的重要来源之一。多糖对保持细胞活性、增强免疫器官功能、维持细胞正常生命代谢具有重要意义。目前关于轮叶党参的研究主要集中在粗多糖提取方法及生物活性,对轮叶党参多糖的分离纯化、结构分析以及分离组分的生物活性研究较少。根据文献[9],利用热水浸提得到的轮叶党参多糖含量为8.50%。轮叶党参粗多糖可显著增强小鼠单核巨噬细胞系统的吞噬功能,对提高小鼠免疫力具有一定作用,2 g/kg轮叶党参粗多糖对小鼠移植瘤S180抑制率为54%[10]。

研究拟以吉林省长白山区轮叶党参为原料,利用水提醇沉、脱脂、脱蛋白、脱色、DEAE-纤维素阴离子柱层析、SephadexS-300葡聚糖柱层析等方法制备轮叶党参多糖组分,利用物理、化学方法结合波谱分析揭示轮叶党参多糖结构特征,以期为进一步研究轮叶党参多糖结构与活性的关系提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

轮叶党参:吉林省长白山区轮叶党参种植基地;

L(+)阿拉伯糖、L(+)鼠李糖、D(+)木糖、D(+)半乳糖、D(+)木糖、D(+)甘露糖:优级纯,美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

气相色谱仪:GC-14C型,日本岛津公司;

高效液相色谱仪:LC-10A型,日本Shimadzu公司;

数显恒温水浴锅:HH-2型,江苏省金坛市科技仪器有限公司;

旋转蒸发器:E-52型,上海医疗器械厂;

高速离心机:LG10-2.4A型,北京医用离心机厂。

1.3 方法

1.3.1 轮叶党参多糖的制备

(1) 粗多糖提取:轮叶党参多糖提取条件为超声功率147 W、超声时间15 min、纤维素酶酶解温度45 ℃、加酶量0.7%、酶解pH值4.5[11],过滤后,减压浓缩加入4倍无水乙醇沉淀,冷冻干燥得轮叶党参粗多糖。

(2) 轮叶党参多糖纯化:将轮叶党参粗多糖经无水乙醚脱脂、活性炭脱色、木瓜蛋白酶酶解后再用Sevag法处理4次,DEAE-52纤维素离子柱层析得到3个主要组分轮叶党参多糖组分1(CLPS1)、轮叶党参多糖组分2(CLPS2)和轮叶党参多糖组分3(CLPS3),分离所得的3种多糖CLPS1占48.3%、CLPS2占40.5%、CLPS3占8.15%[12]32-40。

(3) Sephadex S-300葡聚糖凝胶柱层析:经DEAE-52纤维素离子柱层析得到的组分进一步用Sephadex S-300葡聚糖柱层析洗脱,各组分分别溶于少量蒸馏水中,装样,柱规格为Φ1.6 cm×30 cm,洗脱液为0.1 mol/L NaCl,洗脱速度为0.5 mL/min,分别收集洗脱液,利用苯酚—硫酸法测定多糖含量。

1.3.2 CLPS1比旋光度的测定 准确称取一定量的 CLPS1,配制成质量浓度为1 mg/mL的多糖溶液。调节温度20 ℃,按式(1)计算CLPS1的比旋光度。

(1)

式中:

l——旋光管长度,dm;

c——100 mL溶液中含有的样品质量,g;

t——测定时的温度,℃;

λ——钠光谱的D线(589.3 nm);

a——测定的旋光度值;

[a]——比旋光度。

1.3.3 糖醛酸含量测定 采用硫酸—咔唑法。在9支刻度试管中分别加入质量浓度为0,10,20,30,40,50,60,70,80 μg/mL的半乳糖醛酸标准液2 mL,缓慢加入12 mL H2SO4,充分混匀,沸水浴加热10 min,冷却至20 ℃,分别取1 mL 0.15% 咔唑试剂加入到上述9支刻度试管中,混合均匀,放置30 min,在530 nm处测定吸光度,以糖醛酸浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

取样品溶液2 mL,按照上述标准曲线测定方法,平行测定3次取平均值,根据标准曲线计算糖醛酸含量。

1.3.4 CLPS1分子量的测定 精确量取5.0 mg CLPS1溶于1 mL 0.7% Na2SO4中,充分溶解后,用直径为0.45 μm过滤膜过滤,取10 μL糖品进样,利用HPLC分析[12]40-72。

采用CLASS VP HPLC数据分析工作站;示差折光检测器为SHIMADZU RID-10A;分子排阻色谱柱为G3000 PWXL 7.8 mm(ID)×30.0 cm(L);流动相为0.7% Na2SO4;流速为0.5 mL/min;柱温为40 ℃;按上述方法进样葡聚糖标准品。以信号强度为纵坐标和保留时间为横坐标绘制标准曲线,按照标准曲线计算CLPS1平均相对分子质量。

1.3.5 单糖组成分析 采用气相色谱法。根据文献[13]修改如下:准确称取CLPS1 30.0 mg、2 mol/L三氟乙酸(TFA)2 mL放入水解管中,真空密封,120 ℃水解3 h,取0.5 mL乙醇加入到水解液中。待水解完全后加入1 mg肌醇和1 mL 0.1 mol/L Na2CO3,30 ℃恒温50 min,加入50 mg KBH4,25 ℃保持1.5 h,用乙酸调节pH至中性,在温度40 ℃,真空度为0.06 MPa条件下干燥1 h,加1 mL正丙胺和1 mL吡啶,55 ℃反应30 min后干燥,再次加入0.5 mL吡啶和0.5 mL乙酸酐,90 ℃保温1 h,然后经低温真空干燥得到样品,再用二氯甲烷溶解,取上清液进行气相色谱(GC)测定。

色谱柱为Rtx2330石英毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.2 mm);气化室温度为250 ℃;FID氢焰检测器;程序升温为170 ℃,保持2 min,以8 ℃/min升至240 ℃,保持1 min,再以8 ℃/min升至265 ℃,保持20 min;进样温度为275 ℃;检测器温度为300 ℃;进样量1 μL;载气为氮气;流速为1.5 mL/min。

1.3.6 红外光谱(FT-IR)分析 根据文献[14]。

1.3.7 NMR分析 将10 mg CLPS1溶于1 mL D2O中,利用核磁共振仪测定1H NMR、13C NMR谱[15]。

1.3.8 部分酸水解 称CLPS1 125 mg置于试管内,加入2.5 mL蒸馏水和2.5 mL 0.1 mol/L三氟乙酸溶液,充分混匀,95 ℃水解8 h。快速降温至20 ℃,4 000 r/min离心10 min,干燥沉淀。上清液用蒸馏水透析24 h,袋外透析液浓缩,调整pH至中性,真空干燥。袋内液加5倍体积无水乙醇,醇沉8 h,4 000 r/min离心10 min,上清液和沉淀分别冷冻干燥,将所有干燥样品用气相色谱分析。

1.3.9 高碘酸氧化 根据文献[16]修改如下:准确称取CLPS1 10 mg,用少量蒸馏水溶解,加入30 mmol/L NaIO40.5 mL定容至10 mL,20 ℃避光反应,每隔6 h取0.1 mL样液至氧化完全为止。反应液稀释250倍,以蒸馏水作对照,在波长223 nm处测光密度值,计算高碘酸的消耗量。

以溴甲酚红作指示剂,用0.005 mol/L NaOH滴定2 mL反应液,计算甲酸生成量。

1.3.10 Smith降解 溶液用流水和蒸馏水分别透析24 h,浓缩,加入NaBH4反应10 h。用50% HAc中和至pH为7,流水及蒸馏水透析24 h。取1/3干燥后用于气相色谱分析,剩余2/3用于Smith降解。

加入1∶1体积比的1 mol/L H2SO4,20 ℃水解40 h,BaCO3调整pH为6,过滤,滤液用蒸馏水透析48 h,袋外部分干燥做气相色谱分析,袋内加乙醇,8 h后离心,上清液及沉淀部分分别干燥后做气相色谱分析。

1.3.11 酯化还原反应 准确称取N-环已基-3-(2-吗林代已基)碳二亚胺对甲苯黄酸盐0.75 g加入30 mL 1 mg/mL CLPS1水溶液中,用0.01 mol/L HCl调pH至4.75。反应3 h后,加入15 mL 2 mol/L KBH4,用4 mol/L HCl调pH值至中性,蒸馏水透析3 d,减压干燥,重复反应,直至还原产物无半乳糖醛酸。将干燥过的还原产物甲基化3次,至甲基化完全,得到N-环已基-3-(2-吗林代已基)碳二亚胺酯化还原后的甲基化产物。

1.3.12 甲基化分析 根据文献[17]修改如下:

(1) CLPS1-二甲亚砜溶液的制备:称取CLPS1 20.0 mg,溶于6 mL二甲亚砜(DMSO)中,充入惰性气体N2封管,使CLPS1充分溶解。

(2) NaOH-DMSO混悬液的制备:将240 mg的NaOH与6 mL DMSO,充N2密封,研磨充分形成混悬液。

(3) 甲基化:将NaOH-DMSO混悬液加入CLPS1-DMSO溶液中,充N2密封,磁力搅拌1.5 h,加入3.6 mL碘甲烷,密封,反应7 min后加入6 mL蒸馏水,产物流水透析24 h,蒸馏水透析24 h。

(4) 萃取甲基化多糖:将反应液浓缩至10 mL,加入10 mL CHCl3,充分振荡30 min,萃取甲基化多糖。用蒸馏水充分洗涤萃取液,真空干燥除去CHCl3至1 mL。

(5) 水解反应:将甲基化的多糖,加1 mL 85% HCOOH,充N2封管,沸水反应5 h,然后加调整pH为中性,低温真空干燥,再加入2 mL 2 mol/L C2HF3O2,沸水水解6 h,调整pH为中性后除去乙醇。

(6) 还原反应:加入70 mg NaBH4反应24 h,常温搅拌;然后加入少量强酸型阳离子交换树脂,搅拌2 h后过滤,向滤液中加入甲醇去除硼酸至pH 7,低温真空干燥。

(7) 乙酰化:加乙酐0.5 mL、吡啶0.5 mL,100 ℃反应2 h后低温真空干燥。

1.3.13 数据分析 利用Excel整理数据,采用Microsoft Visio软件绘图,IBM SPSS Statistics25软件对数据进行分析处理,各试验重复3次。

2 结果与讨论

2.1 Sephadex S-300葡聚糖凝胶柱层析

图1～图3为轮叶党参多糖经DEAE-52纤维柱层析后,由Sephadex S-300葡聚糖柱色谱用蒸馏水洗脱得到的3个洗脱峰,分别对应CLPS1、CLPS2、CLPS3 3种多糖,其保留率分别为94.12%,92.31%,90.50%。CLPS1、CLPS2、CLPS3多糖洗脱曲线均为单一洗脱峰,并且峰形呈对称状态,证明每种组分为均一多糖。经前期试验[18]得出,CLPS1、CLPS2、CLPS3组分对DPPH·清除能力的IC50值分别为(3.04±0.35),(3.87±0.36),(4.21±0.12) mg/mL,CLPS1的抗氧化性强于CLPS2和CLPS3。

图1 CLPS1、CLPS2和CLPS3 Sephadex S-300葡聚糖凝胶层析曲线

2.2 糖醛酸含量测定

图2为所得的半乳糖醛酸标准曲线。回归方程为:Y=0.007 8X-0.018 5,R2=0.999 2。经测得CLPS1总糖含量为97.6%,糖醛酸为13.18%,说明得到的CLPS1组分纯度较高。温度20 ℃时,光源为D钠光,波长589.3 nm,CLPS1比旋光度为右旋44.0。

图2 半乳糖醛酸标准曲线

2.3 CLPS1相对分子质量分析

多糖的相对分子质量是影响多糖活性、水溶液状态及其构型主要因素之一,由图3可知,在保留时间为11.156 min时出峰,洗脱峰所对应的相对分子质量为91.7,此时色谱图峰型呈对称状态,较狭窄,说明纯度较高,相对分子质量分布范围较小。

图3 CLPS1高效液相色谱图横坐标

2.4 单糖组成分析

采用气相色谱法对CLPS1单糖组成进行分析(图4),CLPS1水解后检测出5种单糖成分,根据保留时间判断单糖分别是阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和甘露糖,其摩尔比为2.7∶3.4∶2.3∶1.1∶0.5。葡萄糖和阿拉伯糖为主要成分,甘露糖含量最低,与对照组相比纯化后的多糖没有杂质。

图4 CLPS1的气相色谱图

2.5 CLPS1的红外光谱分析

由图5可知,CLPS1红外光谱图出现与糖类结构相关的特征吸收峰,3 388 cm-1处的强吸收峰为O—H伸缩振动,因为多糖分子含有大量羟基,形成的分子内和分子间氢键使在3 388 cm-1处的峰特别宽。2 911 cm-1处出现的吸收峰为C—H伸缩振动,1 371 cm-1处吸收峰为C—H的特征吸收峰,在1 636 cm-1处强吸收峰为羧基离子的特征吸收峰,在1 415 cm-1的弱吸收峰是C—H的变角振动,说明有醇类物质存在,表明在CLPS1中存在糖醛酸。在1 061 cm-1处出现的吸收峰是糖环骨架C—O和C—O—C的伸缩振动为吡喃糖特征吸收峰。在842,889 cm-1处出现特征吸收峰说明存在α-构型和β-构型。根据红外光谱特征峰表明CLPS1为酸性均一吡喃糖,结构中含有半乳糖醛酸、β-构型的多糖抗氧化能力可能显著提高[19]。

2.6 CLPS1的1H NMR分析

采用核磁共振对CLPS1碳的基本骨架分析,由图6可知,CLPS1化学位移在δH0与δH5.0 之间。高场区为δH2.11与δH2.12,说明结构中有O-乙酰基,在低场区δH5.19有强信号,为呋喃型的a-L-阿拉伯糖异头质子,阿拉伯糖质子信号主要集中在δH5.1与δH5.5。在δH5.05左右处为a-D-半乳糖醛酸异头质子。δH3.90处的强信号为半乳糖醛酸的异头质子信号,这与单糖测定及红外光谱检测到的半乳糖醛酸在1 636,1 415 cm-1处出现吸收峰结果一致,均证实了有半乳糖醛酸和阿拉伯糖的存在,CLPS1为酸性多糖。

图6 CLPS1的1H NMR图谱

2.7 CLPS1的13C NMR分析

由图7可知,高场区出现甲基峰其化学位移δC17.603,δC21.709出现信号峰说明有乙酰基,δC26.013 出现信号峰说明存在O-乙酰基,表明乙酰基取代在CLPS1残基的不同位置,δC77.745 表明半乳糖中存在C-4取代。

图7 CLPS1的13C NMR图谱

2.8 部分酸水解产物分析

利用部分酸水解法对CLPS1组成进行分析,部分酸水解后结果如图8所示。对CLPS1部分酸水解液直接离心,沉淀中有半乳糖、阿拉伯糖和微量的半乳糖醛酸,说明CLPS1主链主要由阿拉伯糖和半乳糖组成;从袋外透析液中检测出半乳糖和葡萄糖,说明支链和主链的末端残基是半乳糖和葡萄糖;经袋内醇沉后,在上清液中检出半乳糖、葡萄糖和微量的半乳糖醛酸,证明CLPS1支链或主链边缘含有半乳糖和葡萄糖;袋内醇沉、离心后,沉淀中检出半乳糖和阿拉伯糖,说明CLPS1主要结构是由半乳糖和阿拉伯糖组成的。研究[20]证明,单糖种类较多的多糖可能对神经炎起到对抗作用,琵琶甲多糖由甘露糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸等10种单糖组成,10 μg/mL的琵琶甲多糖对脂多糖诱导的小鼠小胶质瘤细胞有一定抑制作用。

图8 CLPS1酸水解气相色谱分析

2.9 CLPS1高碘酸氧化与Smith降解

由表1可知,经完全酸水解后,水解液中检测出甘油、赤藓醇、半乳糖和半乳糖醛酸,未检测到赤藓酸、阿拉伯糖和葡萄糖,高碘酸能氧化葡萄糖和阿拉伯糖键型,存在甘油和赤藓醇,说明CLPS1结构中有1→4,6、1→、1→2,6、1→2、1→6、1→4键型。半乳糖中有1→2,3,4、1→2,3、1→3、1→2,4、1→3,4、1→3,6;半乳糖醛酸为1→2,3,4、1→3,4、1→3、1→2,3、1→2,4;经Smith降解后袋内无沉淀,上清液中没有检测出目标物,说明主链部分已经氧化完全,袋外部分没有检测出赤藓醇、阿拉伯糖和葡萄糖,检测出半乳糖和半乳糖醛酸,说明半乳糖醛酸和半乳糖中不能被高碘酸氧化的键型与能被高碘酸氧化的键型间隔排列。

表1 CLPS1高碘酸氧化及Smith降解产物分析†

经过高碘酸氧化72 h,试样和高碘酸用量分别为0.14 mmol,高碘酸和己糖消耗量摩尔比为0.98,生成0.04 mmol甲酸,甲酸生成量和己糖摩尔比为0.28。氧化反应结束后检测出甲酸,说明半乳糖、葡萄糖存在1→或1→6键型。高碘酸反应量多于甲酸生成量,说明存在1→2、1→2,6、1→4、1→4,6键型。平均每摩尔己糖残基产生0.291 mol甲酸,每10个己糖残基有1→6糖苷键。

2.10 甲基化与酯化分析

由表2可知,CLPS1末端残基为葡萄糖,半乳糖分支点是葡萄糖(1→4,6)、半乳糖(1→3,6);半乳糖有1→、1→3、1→4、1→6、1→3,6键型;葡萄糖有1→、1→4、1→4,6键型;阿拉伯糖只有1→5一种键型,其中阿拉伯糖(1→5)摩尔比为4.02,其次是半乳糖(1→6)摩尔比为1.60。半乳糖酯化前和酯化后数量增量差是因为半乳糖醛酸还原成了半乳糖。由表3可知,葡萄糖(1→)摩尔比为1.02,说明葡萄糖少数以端基碳原子的形式存在,葡萄糖(1→4)摩尔比为0.83,葡萄糖(1→4,6)摩尔比为1.10,说明多数葡萄糖以侧链的形式存在,半乳糖多数以侧链的形式存在,少数以端基碳原子形式存在,阿拉伯糖(1→5)全部以侧链的形式存在,不存在端基碳原子。从表4可知,半乳糖(1→3)由还原前0.56增加到还原后的1.77,说明半乳糖醛酸可能含有1→3键型。半乳糖酯化前和酯化后数量差为半乳糖醛酸还原成半乳糖后的增量。由表5可知,半乳糖(1→3)数量增加,说明半乳糖醛酸可能含有1→3键型。

表2 CLPS1甲基化产物分析

表3 酯化还原后CLPS1甲基化产物分析

表4 CLPS1甲基化产物和酯化还原甲基化产物中半乳糖的对比分析

表5 CLPS1 甲基化糖摩尔比

3 结论

轮叶党参经水提取醇沉、纯化分离后得到轮叶党参多糖组分1,其总糖含量为97.6%,糖醛酸为13.18%,相对分子质量为91.7。气相色谱分析表明,轮叶党参多糖组分1为一种结构复杂的酸性多糖,主要单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、甘露糖,其中葡萄糖含量最高。红外光谱扫描发现,轮叶党参多糖组分1具有多糖的特征吸收峰,含有α-和β-两种苷键构型,主链由阿拉伯糖和半乳糖组成,半乳糖和葡萄糖形成支链和主链的末端残基。β-构型吡喃糖且含有糖醛酸可能有助于提高多糖抗氧化能力[21],轮叶党参多糖组分1结构中存在β-构型可能是轮叶党参多糖组分1抗氧化能力较强的原因之一。另外,轮叶党参多糖组分1结构中存在羧基、羟基、醛基和酮基等吸电子基团,能提供更多的氢离子中和自由基也提高了多糖的抗氧化能力。

多糖的结构决定着多糖的生物活性,已经证实一些植物多糖的抗氧化能力与单糖和糖苷键连接方式、空间构象、相对分子质量、官能团和支链的分支化程度以及单糖组成有关。有研究[22]表明,多糖活性与降解产生的多糖相对分子质量大小有关,轮叶党参多糖组分1进一步降解产生低相对分子质量多糖可能会提高其抗氧化性。多糖的糖醛酸数量也与抗氧化能力呈正相关[23],轮叶党参多糖组分1中糖醛酸的存在增加了其抗氧化能力。因此,研究多糖结构对分析多糖生理功能具有重要意义。后续将依据轮叶党参多糖组分1结构特征对其生理活性展开深入研究。