HPLC法同时测定湘莲中芦丁、金丝桃苷及槲皮素含量

钟菲菲 李 静 雷德卿 杨 韵 伍健芳 欧阳丽

(长沙市食品药品检验所,湖南 长沙 410008)

莲(NelumbonuciferaGaerth.)为莲科莲属多年水生草本植物,在中国南北各省均有种植,主要产于湖南、浙江等地,尤以湘莲最为著名,被誉为“中国第一莲子”[1]。莲子富含淀粉、蛋白质、脂肪、多种维生素、糖类、钙、磷、铁和钾等营养成分[2],具有抑菌、抗炎、抗氧化等药理作用[3]。其药用有效成分以生物碱和黄酮类化合物为主,其中黄酮类化合物主要包括芦丁、金丝桃苷及槲皮素。有研究发现,金丝桃苷对肾组织具有保护作用[4];芦丁可通过下调NF-κB信号通路缓解右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的大鼠溃疡性结肠炎(UC)[5];槲皮素具有抗氧化、抗病毒、抗炎及保护心、脑和肝脏的作用[6]。

黄酮的测定方法主要有超高效液相色谱法[7]、荧光分光光度法[8]、紫外—可见分光光度法[9]、高效液相色谱法[9]、超高效液相色谱—串联质谱法[10]等。其中,高效液相色谱法对中药材中的目标成分及杂质有很好的分离效果、高灵敏度、结果稳定和操作简单等优点,在黄酮分析检测中的应用较广。李静等[11]曾采用高效液相色谱法同时测定分心木中芦丁、金丝桃苷及槲皮素的含量,但未见采用高效液相色谱法同时测定湘莲中芦丁、金丝桃苷及槲皮素含量的报道。研究拟建立采用高效液相色谱同时测定湘莲中芦丁、金丝桃苷和槲皮素含量的定量分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦丁对照品:含量98.24%,斯坦福石油化工有限公司;

金丝桃苷对照品:含量94.9%,中国食品药品检定研究院;

槲皮素对照品:含量99.1%,中国食品药品检定研究院;

乙腈、甲醇:色谱纯,美国默克公司;

磷酸、甲酸:分析纯,国药集团化学试剂公司;

超纯水:实验室自制;

湘莲:采自湖南省14个地市州,采摘时间为2022年7—9月,晒干。

1.2 主要仪器设备

高效液相色谱仪:Waters alliance e2695型,带自动进样器,2996PDA检测器,美国Waters公司;

电子分析天平:METTLER XS205DU型,瑞士梅特勒—托利多公司;

纯化水系统:Millipore Milli-Q Direct 8型,美国密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),二元流动相,流动相A为甲醇,流动相B为0.6%磷酸,采用梯度洗脱(洗脱程序:0 min,18% A,82% B;35 min,33% A,67%B;40 min,34% A,66% B;45 min,35% A,65% B;50 min,40% A,60% B),流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,检测波长255 nm,进样量20 μL。

1.3.2 供试品溶液的制备 湘莲样品干燥粉碎,取湘莲干燥粉末(粒径180～250 μm),精密称取约50 g,置于1 000 mL锥形瓶中,加75%乙醇约500 mL,超声(840 W,40 kHz)处理1 h,蒸发溶剂至约100 mL,离心(8 000 r/min)3 min,收集上清液,用60 mL氯仿萃取2次,收集乙醇层,蒸发溶剂至近干,加甲醇溶解并定容至1 mL,用0.2 μm微孔滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液。

1.3.3 对照品溶液的制备 精密称取芦丁25.31 mg,金丝桃苷25.83 mg,槲皮素26.55 mg,置25 mL容量瓶中,用甲醇(80%)—乙腈(20%)溶解并稀释至刻度,摇匀,制成约1 mg/mL的标准储备液。精密量取标准储备液0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0 mL分别置100 mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,得到3种成分的系列浓度的标准曲线工作液,每1 mL含芦丁、金丝桃苷及槲皮素约为2,5,10,20,50,100,200 μg。

1.3.4 高效液相色谱条件优化

(1) 吸收波长:使用紫外分光光度计,对芦丁、金丝桃苷及槲皮素3种待测成分在200～400 nm范围扫描,选择最佳吸收波长。

(2) 流动相的优化:采用色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),PDA检测器,最佳检测波长,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,检测波长255 nm,进样量20 μL。比较不同流动相:乙腈—磷酸水溶液(0.2%,0.4%,0.6%)、甲醇—磷酸水溶液(0.2%,0.4%,0.6%)对3种黄酮类物质的分离效果。

(3) 溶剂的选择:采用色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),PDA检测器,最佳检测波长,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,检测波长255 nm,进样量20 μL。比较不同溶剂配比(V甲醇∶V乙腈分别为100∶0,80∶20,60∶40,50∶50,40∶60,0∶100)对3种黄酮类物质的分离效果。

1.3.5 湘莲中芦丁、金丝桃苷及槲皮素提取方法的优化

(1) 湘莲粉末粒径选择:取3种不同粒径(>355,180～250,<150 μm)的湘莲干燥粉末,采用超声提取(840 W,40 kHz),提取时间为1 h,蒸发溶剂至约100 mL,离心(8 000 r/min)3 min,收集上清液,最优HPLC条件测定3种黄酮类物质含量。

(2) 提取时间选择:取湘莲干燥粉末(180～250 μm),采用超声提取(840 W,40 kHz),提取时间分别为0.5,1.0,1.5,2.0 h,分别蒸发溶剂至约100 mL,离心(8 000 r/min)3 min,收集上清液,最优HPLC条件测定3种黄酮类物质含量。

(3) 提取溶剂选择:取湘莲干燥粉末(180～250 μm),采用超声提取(840 W,40 kHz),提取时间1 h,选择不同体积分数的甲醇和乙醇(50%甲醇、50%乙醇、60%甲醇、60%乙醇、75%甲醇、75%乙醇、90%甲醇、90%乙醇)作为溶剂提取湘莲中3种黄酮,考察提取溶剂对湘莲中3种黄酮类物质定量的影响。

(4) 料液比选择:取湘莲干燥粉末(180～250 μm),采用超声提取(840 W,40 kHz),提取时间1 h,提取溶剂为75%乙醇,考察料液比[1∶2,1∶5,1∶10,1∶15 (mg/mL)]对湘莲中3种黄酮类物质提取效果的影响。

(5) 提取方法选择:取湘莲干燥粉末(180～250 μm),提取时间1 h,提取溶剂为75%乙醇,料液比1∶10 (mg/mL),分别采用超声(840 W,40 kHz)和热回流提取湘莲中3种黄酮类物质,考察提取方法对湘莲中3种黄酮类物质定量的影响。

1.4 数据处理

将仪器测得的数据结果使用Excel 2010软件记录、处理计算。提取色谱图通过仪器软件导出csv数据文件,使用Origin 8.5绘图软件重新绘制。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱图

如图1所示,按1.3.1的色谱条件进样,芦丁、金丝桃苷和槲皮素的保留时间分别为41.07,42.81,47.92 min。样品中的目标峰具有良好的峰型和分离度,杂质峰对目标峰的含量测定没有干扰。因此,在该色谱条件下所测得的结果可以代表芦丁、金丝桃苷和槲皮素的含量。

图1 混合对照品和样品HPLC色谱图

2.2 色谱条件优化

2.2.1 波长选择 精密量取1.3.1项下供试品溶液0.1 mL,加甲醇定容至10 mL容量瓶,摇匀。取芦丁、金丝桃苷及槲皮素对照品,加甲醇溶液(浓度适量)作对照,在紫外可见光分光光度计200～400 nm进行全波长扫描,以甲醇为空白溶剂。结果供试品和芦丁、金丝桃苷及槲皮素对照品均在255 nm处有最大吸收,故确定其为检测波长。

2.2.2 溶剂选择和优化 如图2所示,当溶剂中乙腈体积分数>40%时,槲皮素含量明显降低;以甲醇(60%)—乙腈(40%)为溶剂时,槲皮素的色谱峰拖尾严重;以纯甲醇为溶剂时,芦丁及金丝桃苷分离度<1.5,而且芦丁色谱峰存在前延和变形问题。综合考虑目标物质峰的响应值、拖尾因子、分离度和峰宽,最终选择甲醇(80%)—乙腈(20%)作为溶剂溶解稀释标准品。

图2 不同溶剂的色谱图

2.2.3 流动相的选择和优化 芦丁和金丝桃苷的极性相似,但槲皮素的极性与二者相差较大,故选择梯度洗脱。如图3所示,当流动相为甲醇—0.2%磷酸水溶液和甲醇—0.4%磷酸水溶液时,3种黄酮类物质的分离效果差,可能是流动相的酸度不够;以甲醇—0.6%磷酸水溶液为流动相时,3种物质的目标峰分离效果较好,分离度均大于1.5,且峰形较好。0.6%磷酸水溶液pH为2.3,考虑到pH≤2时会缩短色谱柱的使用寿命,因此不再选用更高酸度的磷酸水溶液作为流动相。与甲醇相比,乙腈作为流动相时,3种黄酮类物质的保留时间靠前,湘莲药材的杂质峰可能会干扰目标物质的测定,综合考虑目标峰洗脱时间和分离效果,选择甲醇—0.6%磷酸水溶液作为流动相。

图3 不同流动相的色谱图

2.3 提取条件优化

2.3.1 湘莲粉末粒径对3种目标物含量的影响 由表1可知,湘莲粉末粒径>355 μm或<150 μm时3种黄酮类物质的提取率均比粒径为180～250 μm的低,原因可能是粉末粒径过大,与溶剂接触的比表面积小,有效成分渗出少;粉末过细,颗粒表面积大,其吸附作用强,会影响3种目标物质的扩散速度,同时杂质提取量也会增加,干扰目标物质的定量。故湘莲粉末粒径选择180～250 μm。

表1 粉末粒径对3种目标物含量的影响

2.3.2 提取时间对3种目标物含量的影响 由表2可知,提取时间为0.5 h时,3种黄酮类物质的提取率较低;提取时间为1.0 h与提取时间为1.5 h的芦丁、金丝桃苷及槲皮素的提取率相近;提取时间为2 h时,3种黄酮类物质虽然提取率较高,但杂质峰较多。综合分析,提取时间选择1.0 h。

表2 提取时间对3种目标物含量的影响

2.3.3 提取溶剂对3种目标物含量的影响 由表3可知,乙醇溶液提取效果优于甲醇溶液,可能是乙醇与3种黄酮类物质的极性相近。不同体积分数的乙醇溶液中,75%乙醇的提取效果最佳,乙醇体积分数过高会使湘莲粉末中的糖类物质、脂溶性物质大量析出,导致3种目标物质的定量受到影响;当乙醇体积分数过低时,湘莲粉末中3种目标物的含量明显降低。因此,提取溶剂选择75%乙醇溶液。

表3 提取溶剂对3种目标物含量的影响

2.3.4 料液比对3种目标物含量的影响 由表4可知,随着液料比值的增大,3种目标物质的提取率先增大后趋于平衡。考虑到耗材用量、人力及时间,料液比选择1∶10 (mg/mL)。

表4 料液比对3种目标物含量的影响

2.3.5 提取方法对3种目标物含量的影响 由表5可知,采用热回流法时芦丁及金丝桃苷的提取率较超声法的低,可能是因为芦丁及金丝桃苷受热易分解,而且超声法设备简单、操作方便、耗时短。因此,选择超声法。

表5 提取方法对3种目标物含量的影响

2.4 线性关系、检出限及定量限考察

以目标物质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线,芦丁、槲皮素及金丝桃苷在质量浓度为5～200 μg/mL的范围内线性良好,相关系数R2均大于0.999。以信噪比S/N≥3确定检出限,以信噪比S/N≥10确定定量限,如表6所示,芦丁、金丝桃苷及槲皮素均有较低的检出限及定量限,有较好的灵敏度。

表6 3种组分线性范围与检测限

2.5 稳定性试验

取湘莲供试品溶液分别于0,4,8,16,24,36,48 h进样,各时间点平行2次,测定湘莲供试品溶液中3种黄酮的平均峰面积。由表7可知,芦丁、金丝桃苷及槲皮素的 均小于2%(n=7),表明湘莲供试品溶液在48 h内稳定,但超过72 h,3种黄酮类物质的峰面积明显降低。

表7 稳定性试验

2.6 精密度试验

取混合对照品溶液,按1.3.1的色谱条件,平行进样6次,测定3种成分的峰面积。由表8可知,芦丁、金丝桃苷及槲皮素峰面积的RSD均小于2%,表明该方法具有良好的精密度。

表8 精密度试验

2.7 重复性试验

按1.3.2的供试品溶液制备方法平行处理6份样品,按1.3.1的色谱条件测定。由表9可知,芦丁、金丝桃苷和槲皮素峰面积的RSD分别为1.8%,1.1%,1.5%,表明该方法的重复性良好。

表9 重复性试验

2.8 回收率试验

取已知含量的湘莲样品9份,每份约25 g,精密称定,按1.3.2的方法处理之前,在9份湘莲样品中分别加入高、中、低3种不同浓度的芦丁、金丝桃苷及槲皮素高、中、低混合的对照品溶液1 mL,质量浓度分别为60,50,40 μg/mL,置振荡器中混匀。按1.3.1的色谱条件测定,计算各对照品的平均加样回收率和RSD值。由表10可知,芦丁、金丝桃苷、槲皮素的平均加标回收率分别为96.6%,96.9%,97.4%,RSD值分别为1.3%,1.5%,1.5%(n=9),表明该方法的加样回收率符合要求,对结果的准确度影响小。

表10 回收率试验

2.9 耐用性试验

按1.3.2的方法平行处理2份样品,更改柱温条件(25,30,35,40 ℃)、流动相pH值(2.0,2.5,3.0,3.5)及色谱柱(Agilent-C18柱、Waters-C18柱、Thermo-C18柱),其他条件参照1.3.1。由表11～表13可知,同一供试品在改变柱温条件下,芦丁、金丝桃苷和槲皮素的RSD分别为2.8%,2.2%,2.4%;同一供试品在改变流动相pH值条件下,芦丁、金丝桃苷和槲皮素的RSD分别为2.1%,1.8%,1.9%;同一供试品在改变色谱柱的条件下,芦丁、金丝桃苷和槲皮素的RSD分别为1.7%,0.9%,1.4%。湘莲供试品溶液在柱温、流动相pH值及色谱柱条件微小变化后,3种黄酮类物质色谱峰分离良好,对结果的测定没有较大的影响,说明该方法具有良好的耐用性。

表11 柱温耐用性试验

表12 pH值耐用性试验

表13 色谱柱耐用性试验

2.10 重现性

不同的分析人员在不同的实验室取同一批次湘莲样品,各按1.3.2的方法平行处理5份样品,按1.3.1的色谱条件进样检测。由表14可知,该方法具有良好的重现性。

表14 重现性试验

2.11 样品的含量测定

取20批湖南省14个地市州的湘莲样品粉末各50 g,先按1.3.2项下的样品处理方法制备,再按照1.3.1项下的色谱条件测定样品中芦丁、金丝桃苷及槲皮素含量。由表15可知,20批湘莲样品中芦丁、金丝桃苷及槲皮素含量的平均值分别为1.62,1.78,2.29 mg/kg,不同产地和采收季节均会对湘莲中的芦丁、金丝桃苷及槲皮素含量有一定程度的影响。从产地看,湘潭的莲子中芦丁、金丝桃苷及槲皮素的含量最高,可能是因为湘潭位于湘江下游,气候湿润,年平均气温为17 ℃左右,形成了湘莲生产的有利地理条件;从采收季节看,湘潭、永州、怀化、衡阳和娄底地区8月份采收的莲子3种黄酮类物质的含量均比7月份的高,可能与阳光照射温度有关,因为南方地区8月份气候温度比7月份高,大部分地区的温度在34 ℃左右,有些地区可能会超过39 ℃,甚至达到40～41 ℃,因此推测夏季三伏天的中伏和末伏期间为莲子比较适合的采收季节。

表15 样品测定结果

3 结论

研究建立了高效液相色谱法测定湘莲中芦丁、金丝研究对湘莲中芦丁、金丝桃苷及槲皮素3种黄酮类物质的分析方法进行了改进,3种黄酮标准品的色谱峰得到了很好的分离且出峰时间适宜。湘莲中有较多黄酮类化合物以及其他类别化合物,试验只对湘莲中3种黄酮类化合物进行了定量分析,尚未对湘莲中其他活性成分做进一步的分离分析,其主要活性成分有待于进一步研究。

桃苷及槲皮素含量的方法。该法采用色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:A相为甲醇,B相为0.6%磷酸,梯度洗脱(洗脱程序:0 min,18% A,82% B;35 min,33% A,67% B;40 min,34% A,66% B;45 min,35% A,65% B;50 min,40% A,60% B),流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;检测波长255 nm;进样量20 μL。芦丁、金丝桃苷及槲皮素在5～200 μg/mL(R2=0.999 9)范围内均有良好的线性关系,回归方程分别为Y=2 527X-1 136、Y=4 818.6X-3 712和Y=2 809.8X-108.4。