母乳中胆盐激活脂肪酶性质及功能的研究进展

杨宝嘉，芦晶，吕加平，逄晓阳，张书文，刘妍妍

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163000；2.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193；3.北京工商大学食品与健康学院，北京 100048）

0 引言

胆盐激活脂肪酶 (Bile salt stimulated lipase，BSSL)也被称为羧酸酯脂肪酶和胆固醇酯酶是一种对各种脂类具有活性的酯酶，包括甘油酯、胆固醇和脂溶性维生素。早期，认为肠腔内的BSSL 起源于乳腺或胰腺[1]。进一步研究发现在血小板、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和肝脏、内皮细胞等也有表达[2]。BSSL 也是一些哺乳动物母乳的重要组成部分，如人类、小鼠等，但不包括大鼠和牛。众所周知，新生儿的健康快速的成长需要饮用优质的脂肪和必需营养素。然而，婴儿外分泌胰腺在出生时是不成熟的，分泌BSSL 的含量不足以支持脂肪的充分吸收[3]。但这种脂肪吸收不良现象几乎只出现在配方奶喂养的婴儿中，母乳喂养则不会出现该情况。1977年，Olle 首次报道BSSL 在人乳中大量存在，约占人乳蛋白总量的1%[4]。

1 BSSL 的结构及性质

理化性质：BSSL 发挥作用的最适pH 值为7.3～8.6，但在酸性环境下也仍能发挥作用，在pH3.5，37 ℃的环境1 h 也仍能保持活性不被破坏[1]。因此，这也可以说明在其经过胃部的酸性环境条件，到达十二指肠时BSSL 活性可以保持稳定而不被破坏。但BSSL 对高温敏感性极强，如巴氏杀菌（62.5 ℃，30 min）会使BSSL完全丧失失活，但低温冷藏、冻融对BSSL 的活性几乎无影响。人奶中的乳铁蛋白可以使BSSL 活性提升近1.4 倍；毒扁豆碱和二异丙基氟磷酸对BSSL 活性具有抑制作用[5]。

基因结构特点：BSSL 基因位于9 号染色体长臂端粒部分，位于9q34.3 位点，基因全长9850 bp，具有11个外显子和10 个内含子[6]。BSSL 活性需要被胆盐激活正是由于外显子4 编码由Gly117 至Glu130 间一致序列组成的环状结构，一旦胆盐结合后此环便移开，底物便会进入酶活性位点[7]。在没有胆盐分子的情况下，有研究表明这种酶具有预先形成的催化位点和功能性氧阴离子孔[8]，这解释了酶对水溶性酯的活性。

蛋白质结构特点：母乳来源的BSSL 包含722 个氨基酸的单一肽段，含有16 个PEST 重复（重复序列为PVPPPTDSQ）[5]。BSSL 的活性位点是位于435 位组氨酸，320 位天冬氨酸和位于194 位丝氨酸的催化三联体结构牛磺胆盐是最有效的激活胆盐激活脂肪酶的胆盐[9]。含有1 个N-糖基化位点和9 个O-糖基化位点[10]，这使BSSL 在抗菌抗病毒方面具有重要作用；也正是因为BSSL 的该结构，有学者提出BSSL 在免疫调节方面具有潜在的功能特性。

2 影响BSSL 浓度的因素

影响母乳中BSSL 质量浓度的因素：首先，成熟乳中BSSL 浓度大于初乳（产后0～3 d）中BSSL 浓度，初乳中的BSSL 质量浓度（71.49±40.61）μg/mL[11]。胎龄对母乳中BSSL 的浓度存在影响，有学者研究了并证明了早产儿母亲BSSL 浓度略高于足月儿母亲[11]。Pamblanco M 等人[12]也认为，胎龄可能会影响BSSL 浓度。因此我们可以认为母乳喂养的早产儿与足月新生儿相比，可能获得相同或更大的脂肪消化能力，从而改善能量获取，使早产儿在早期生活中赶上足月婴幼儿生长发育。其次，孕期肥胖与初乳中BSSL 浓度呈现负相关，这可能是由于母乳中BSSL 浓度受到催乳素的影响，肥胖的母亲催乳素水平较低，从而导致了BSSL 分泌的减少。众所周知，孕期肥胖会增加患有孕期和产后并发症的几率，并且对胎儿和新生儿的身体健康产生不良影响[13]。因此，早期营养过剩是肥胖和代谢综合征的危险因素，不仅会影响自身健康也会对婴儿的健康产生深远的影响。妊娠期糖尿病对初乳中BSSL 浓度有显著影响，患有妊娠期糖尿病的母亲初乳中BSSL 浓度较低，由于葡萄糖和胰岛素随着血液循环进入母乳中[14]，母乳中葡萄糖和胰岛素水平升高，可能会影响乳腺分泌BSSL。婴儿的性别不同BSSL 浓度也存在差异，研究表示女婴则母乳中BSSL 浓度比男婴高10 μg/mL。最后，随着泌乳时间的延长，BSSL 浓度会随之下降，有学者跟踪测定了产后6 个月的母乳中BSSL 浓度发现，随着婴儿的成长，消化系统的成熟，BSSL 浓度逐渐降低且有趋于零的趋势[15]。

3 不同杀菌方法对BSSL 活性的影响

巴氏杀菌法是一种比较温和的通过加热的方式，杀灭生鲜乳中大多数的病原体和腐败菌[16]。目前大部分人乳库中都使用巴氏杀菌的方法。人乳在62.5 ℃水浴中加热30 min，这能使人乳中大肠杆菌、阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌减少5-10 倍，但这样的条件会导致乳中活性成分含量减少甚至完全丧失；BSSL 在这种杀菌条件下会完全丧失活性而免疫球蛋白的含量会显著降低[17]。高压处理是一种非热加工处理的方法，是通过对整个样品快速、均匀的加压而达到杀菌、延长保质期等目的。高压处理的方法可以减少营养物质的损失、风味可以得到最好的保证、加工过程中污染低等众多优点[18]。紫外线照射是一种物理方法，能有效的控制微生物得污染，主要是由于紫外线对微生物的核酸产生光化学危害、对蛋白质也有危害作用从而导致细胞死亡。紫外杀菌具有无化学残留、杀菌彻底和杀菌用时短等优点[19]。

Koh Jeewon[20]等人通过对比γ-射线，紫外线照射，高压处理，巴氏杀菌等杀菌技术对人乳中BSSL 活性的影响进行研究，发现巴氏杀菌BSSL 的活性降低99.7%；γ-射线处理后的样品BSSL 活性比未经处理的母乳相比降低了70.8%；紫外线处理后使样品中BSSL活性降低64.7%；高压技术处理后使样品中BSSL 活性降低了38.4%。Wesolowska[21]等人，研究了高压处理与巴氏杀菌对母乳中活性成分的影响，发现巴氏灭菌法处理后的母乳脂肪酶活性仅残留2.1%。相比之下，在450 MPa 15 min 条件下高压处理后发现，该条件下最大限度地保留了人乳中的脂肪酶。Lukas Christen[22]等人将7 种菌（阪崎氏肠杆菌、屎肠杆菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌和3 种孢子类菌种）接种人乳样品中，然后用紫外线照射。对未经处理和处理的样品进行细菌含量、BSSL 活性、碱性磷酸酶活性和脂肪酸谱分析，发现紫外线照射可以将母乳中的细菌含量降低到人乳库要求的标准，该方法保留了乳中BSSL 的活性并不改变人乳的脂肪酸组成。综上所述，巴氏杀菌技术几乎可以使人乳中的BSSL 完全损失，而高压处理和紫外照射后BSSL 损失相对较少。

4 BSSL 的生物学功能性质

4.1 BSSL 促进脂代谢作用

BSSL 由乳腺分泌并通过乳汁提供给婴儿，从而弥补内源性脂肪酶的不足[23-24]。刚出生的婴儿从以葡萄糖为主的能量供应转变为以脂质为主的能量供应。母乳中的乳脂主要在乳脂肪球中，其核心成分是甘油三脂（95%以上）被三层膜包裹[25]。除了能量，乳脂还提供必需的营养物质，如n-3 和n-6 长链多不饱和脂肪酸、磷脂和胆固醇，这些物质对出生后第一年大脑和认知功能的发展非常重要。因此，脂类的有效吸收至关重要，不仅对能量利用，对最佳生长也很重要。母乳来源的BSSL 一旦被小肠上部的内源性胆汁盐激活，对婴儿吸收和利用乳脂有显著的贡献[26-27]，可以将甘油三酯水解生成甘油和游离的脂肪酸。因此，BSSL 对早产儿的生长及发育具有重要作用。众所周知，出生后早期生长缺陷可能会对未来的生长、身体健康以及神经系统发育和新陈代谢产生不利影响[28-29]。BSSL 是一种脂肪分解酶，具有广泛的特异性可水解多种不同的底物，例如甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯、胆固醇酯和视黄酯、磷脂和神经酰胺，可促进食物脂肪消化和吸收。婴儿脂肪的消化始于胃部的胃脂肪酶，由胃黏膜上主要的酶原细胞分泌。它主要位于胃底和胃体，并水解甘油三酯的sn-3 位。婴儿胃脂肪酶活性与成人水平相似。乳脂肪膜上的磷脂在胃部不被消化，进入十二指肠后BSSL可以进行催化。在婴儿早期，十二指肠中的胰腺甘油三酯脂肪酶蛋白含量低，胰腺和乳汁中的BSSL 蛋白是小肠中脂肪消化的主要脂肪酶。

婴儿在刚出生时，胰腺外分泌功能并未完全发育，BSSL 产物不足以支持适当的脂肪吸收。因此需要通过母乳提供给婴儿，从而弥补内源性脂肪酶的不足[30-31]。人乳中BSSL 的重要性已在动物模型中得到证明。早在2008年的时候Miller Rita[32]等人进行了动物试验，喂食给小鼠纯化的BSSL，发现BSSL 缺陷型小鼠能正常吸收脂肪，无肠道损害。BSSL 对早产儿的健康生长和发育的重要性已有临床试验证明。有报导将人胆汁盐激活脂肪酶基因在小鼠中表达[33]，转基因母鼠喂养的早产新生鼠的存活率显著增高，并且发现通过对照发现，转基因母鼠喂养的早产鼠体质量增加了43.8%，粪便粗脂肪水平降低了33.3%。Casper Charlotte[34]等人通过临床试验研究重组人BSSL 对早产儿生长速度和脂肪吸收的影响，通过对比发现重组人BSSL 治疗耐受性良好显著改善了婴儿的生长指标和婴儿对长链多不饱和脂肪酸的吸收。综上所述，BSSL 能够促进婴儿对脂肪的消化吸收，并促进生长发育且无肠道损害。

4.2 BSSL 的抗菌抗病毒作用

母乳的各种多功能性成分协同工作，为母乳喂养的婴儿提供广泛的即时的防御，提供母乳先天免疫系统的一部分。母乳喂养可以降低新生儿感染疾病的风险，是由于母乳中含有大量外来抗原和宿主因子，它们与母乳喂养婴儿的食管和肠黏膜相互作用[35]。越来越多的证据表明，母乳可以保护新生儿免受感染，母乳喂养的婴儿与配方奶粉喂养的婴儿相比，因腹泻而导致的发病率和死亡率均有所下降[36-37]。

早在1983年Gillin 就提出了母乳中的脂肪酶可以杀死蓝氏贾第鞭毛虫；不是依赖于分泌性免疫球蛋白A（IgG A）而是与一种不寻常的脂肪酶有关，这种脂肪酶存在于人类的乳中，但不存在于低等哺乳动物的乳中[38]。1985年发现杀死蓝氏贾第鞭毛虫的脂肪酶需要在胆盐的刺激下才能完成[39]。在1986年研究发现这种脂肪酶就是BSSL，杀死蓝氏贾第鞭毛虫需要人乳中的BSSL 起到间接作用，BSSL 水解甘油三酯后释放出游离脂肪酸对贾第鞭毛虫有毒[40]。Naarding 等发现人乳中的BSSL 是一种携带Lewis X 的糖蛋白，可以结合树突细胞上的非整合素分子，抑制HIV 病毒向CD4+T 细胞上转移[41]。有研究证明了母乳中的岩藻糖基化寡糖能够保护母乳喂养的儿童免受腹泻的侵害[42]。Nathalie 等人研究发现[43]含有α1-2 连接岩藻糖的人乳BSSL 可以作为诱饵受体，阻止诺如病毒附着在胃十二指肠组织上，可以起到抑制病毒的效果。综上所述，BSSL 在抗菌抗病毒方面发挥作用的主要原因，一方面是由于其高丰度的糖基修饰，BSSL 能够抑制病原微生物黏附在人上皮细胞的受体。另一方面BSSL的水解产物是游离脂肪酸和单酰甘油酯，具有抗菌抗病毒的作用。

5 BSSL 潜在生物学功能特性

5.1 BSSL 对肠道菌群的调节作用

肠道菌群是定植在肠道内的庞大微生物群落[44]。肠道菌群与Ⅱ型糖尿病[45]、心血管疾病[46]、肥胖[47]等疾病都息息相关，因此新生儿肠道菌群的建立影响其未来的身体健康。母乳是调节婴儿肠道菌群的一个重要的因素，同时也是新生儿营养的最佳来源。婴儿肠道菌群的形成容易受到分娩方式、胎龄、喂养方式、免疫系统、家庭生活方式、地理位置以及益生菌和抗生素的使用等多种因素的影响[48]。

有研究表示，影响肠道菌群建立的最重要因素是喂养方式的不同，Aifric[49]等人认为纯母乳喂养婴儿与配方奶喂养的婴儿在肠道微生物群和生长方面存在很大差异。Bezirtzoglou[50]等人使用荧光原位杂交技术对比了母乳喂养和配方奶喂养的婴儿粪便中的微生物区别，提出采用两种不同喂养方式的婴儿，母乳喂养的婴儿粪便微生物群中的双歧杆菌细胞数量是配方奶粉喂养的婴儿的两倍多。母乳喂养婴幼儿肠道菌群中双歧杆菌数量约为99%, 其他常见菌为0.11%～1%[51]。配方奶粉喂养的婴幼儿，双歧杆菌占比量大约为40%，肠道菌群种除双歧杆菌外, 还包括拟杆菌、肠杆菌、肠球菌和梭状芽孢杆菌等[52]。在分析由与胃肠道相关的所有可用细菌基因组组成的参考基因组时，发现53%的微生物编码的基因在糖解、蛋白水解和脂肪分解活性方面具有同等的特异性。研究表明，人奶中寡聚糖可以促进双歧杆菌和乳酸杆菌的生长，BSSL在初乳中有丰富的寡糖修饰，这些寡聚糖不会被婴儿消化，主要的作用是调节肠道菌群[53]。因此，我们可以认为婴儿肠道菌群的建立及成熟的过程中BSSL 发挥潜在的调作用。

5.2 BSSL 的免疫调节作用

新生婴儿免疫系统尚未发育成熟，容易受到病原微生物及其他有害因素的侵害。在婴儿免疫调节系统尚未发育完全之前，母乳的摄入十分重要；母乳中含有大量的免疫成分[54]，包括：（1）促进免疫发育的细胞:巨噬细胞、噬中性粒细胞、淋巴细胞；（2）促进免疫发育的成分：细胞因子、长链不饱和脂肪酸、核苷、生长因子和其他蛋白；（3）免疫调节因子：抗炎细胞因子、促炎症细胞因子、其它免疫调节物质。不少学者认为纯母乳喂养对新生儿营养状态及免疫状态的影响相对更好[55]。也有学者发现，乳脂球膜能提高婴儿的抵抗力，而BSSL 可以促进乳脂的吸收[56]。虽然，目前并没有研究证明BSSL 在免疫调节方面的功能，但基于糖基化修饰特点，BSSL 很有可能是免疫调节方面的重要组分。这也将成为BSSL 的下一步研究方向。

6 结束语

现已有大量的实验以及临床观察证实了纯母乳喂养的婴儿可以大大降低感染性疾病的发生危险、降低过敏性疾病的发生、促进生长发育、促进智力发育、促进神经系统发育等众多益处[57]。母乳中的BSSL 对乳脂的吸收、胆固醇的吸收都有十分重要的作用，对肠道菌群的建立以及免疫调节方面也有潜在的积极影响。而在婴儿配方奶粉中BSSL 是不存在的，BSSL在巴氏杀菌后也会完全失去活性，因此婴儿额外的补充BSSL 就变得十分重要。现在已经有研究将BSSL 基因成功的在牛及小鼠中表达。未来将对BSSL 进行更加深入的研究为其以后能够批量生产并添加到配方奶粉中奠定基础。