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高通量测序技术探究驴乳粉对皮肤细胞的影响

2022-06-07廖峰樊雨梅帖航赵海晴苏宁

中国乳品工业 2022年5期
关键词:角质纤维细胞细胞因子

廖峰,樊雨梅,帖航,赵海晴,苏宁

(1. 国家胶类中药工程技术研究中心 东阿阿胶股份有限公司,山东 东阿252201;2.中国检验检疫科学研究院,北京 100176)

0 引言

现代药理研究表明,乳及其制品具有促进伤口愈合[1-2]、增加角质层含水量[3]、修复皮肤屏障损伤[4]、提升皮肤弹性[5]、改善寻常粉刺[6]、减轻面部色素沉着[7]、预防UV 辐射引起的皮肤损伤[8-9]以及治疗尿布皮炎[10]和特应性湿疹[11]等活性。驴乳因营养成分有与母乳类似、致敏性低的特点而使其功能研究、质量控制与产品开发成为了研究热点,但是关于驴乳对皮肤影响的报道较少。Kocic[12]等研究发现,驴乳作用于成纤维细胞后,能够促进成纤维细胞增殖,下调NF-κB p65 活性和激活细胞外信号调节激酶。包裹脱脂驴乳的纳米面霜具有显著的瞬时和长效保湿的效果[13]。然而,采用转录组学技术从分子水平探究驴乳与皮肤细胞相互作用机制的研究尚未报道。转录组学测序技术(RNA Sequencing,RNA-Seq)是基于深度测序技术进行转录组分析的方法,具有高分辨率、分析快速等优点[14],是研究细胞表型和功能的一种重要手段。

本研究采用RNA-Seq 分析驴乳对成纤维细胞和角质形成细胞的基因表达影响,筛选出驴乳作用两种皮肤细胞后的相关特异性基因及通路,为阐明驴乳对皮肤健康作用的分子机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

驴乳粉(批号:20190102)由东阿阿胶股份有限公司提供;人角质形成细胞(KC 细胞)、人成纤维细胞(FB 细胞),博溪生物科技有限公司;PBS、青霉素/链霉素、DMEM 培养基,Gibco 公司;Trizol,Invitrogen 公司;反转录试剂盒、Real-PCR 试剂盒,TaKaRa 公司;核酸电泳试剂,天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 仪器

371 二氧化碳培养箱、NanoDrop 2000 微量紫外分光光度计、ABI 7500 荧光定量PCR 仪,Thermos 公司;2100 Bioanalyzer 生物芯片分析系统,Agilent 公司;JY600E 电泳仪,北京君意东方电泳设备有限公司。

1.3 实验样品处理

精密称取驴乳粉样品5.0000 g,加入40 mL 热超纯水,涡旋振荡至完全溶解,转移至50 mL 容量瓶中,用超纯水稀释至刻度线,10000 r/min 离心30 min,取中间澄清溶液,即为质量浓度10%驴乳溶液,并经0.22 μm微孔滤膜处理,备用。

收集对数生长期的细胞,调整细胞密度约为4×105个/mL,接种至6 孔板中,37 ℃,5% CO2中孵育过夜,换上含有驴乳的培养基作为实验组,每孔100 μL。另设阴性对照组,加入相同体积的培养基。每组设置6个平行。加药后,在培养箱(37 ℃,5% CO2)中继续培养24 h 后,弃掉培养液,用PBS 洗涤细胞3 次,备用。

1.4 RNA-Seq 实验

向细胞中加入1 mL Trizol,待融化成液体后转入1.5 mL Ep 管中。Trizol 法提取模型总RNA,并进行质检。RNA 样品检测合格后,用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。随后加入适量打断试剂将mRNA 打断成短片段,以mRNA 为模板合成cDNA。经过磁珠纯化、末端修复、加碱基A 尾并连接测序接头,然后进行PCR 富集得到最终的cDNA 文库。用Agilent 2100 Bioanalyzer 生物芯片分析系统和ABI 7500 荧光定量PCR 仪进行质量和产量检测。文库质控合格后,用Illumina HiSeqTM 2000 进行测序,使用统计学方法对有效数据进行分析。

1.5 数据处理与分析

使用DESeq2 软件对原始测序数据进行差异基因分析。对原始的readcount 进行标准化,用统计学模型计算假设检验概率(p-value),进行多重假设检验校正,得到错误发现率(False Discovery Rate,FDR)FDR。以|log2(fold change)|>1 且P<0.05 为标准筛选出两组差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)。对于筛选出的DEGs 用基因本体论数据库(Gene Ontology)和注释、可视化和整合发现数据库(DAVID)进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。

2 结果与分析

2.1 质控结果

提取高质量细胞总RNA 是后续测序工作的基础。经检验,所有样品的OD260/OD280 的比值均在1.8~2.0 范围内,RNA 纯度较高。根据Illumina 测序要求,所有样品的RIN 值(RNA integrity number,RNA完整值)应该在7 以上,方可用于文库构建和测序分析。用于测序的4 个样本的RIN 值均满足条件,样品质量满足建库测序要求。样品RNA 质量检测信息见表1,4 组样品的RNA 检测结论均为A,表明样品RNA 质量满足建库测序要求,且总量满足2 次或者2次以上建库需要。

表1 测序样品RNA 质检结果

2.2 驴乳作用于皮肤细胞后的DEGs

差异基因统计分析结果显示,与空白对照组相比,驴乳作用角质形成细胞后共筛选出819 个DEGs,其中420 个上调基因,399 个下调基因。DEGs 的整体分布情况见图1(a),其中每一个点代表一个基因,蓝色点表示表达下调的基因,红色点表示表达上调的基因。与空白组相比,驴乳作用成纤维细胞后共筛选出507 个DEGs,其中298 个基因上调,209 个基因下调,DEGs 的整体分布情况见图1(b)。

图1 差异表达基因火山图

2.3 差异表达基因GO 富集分析

为初步明确驴乳在角质形成细胞和成纤维细胞中发挥的具体生物学功能,分别对已鉴定出的DEGs 进行了GO 富集分析。通过GO 富集分析可将差异表达的基因按功能分为:生物过程(biological process,BP)、细胞组分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3 类。

GO 功能富集结果显示见图2(a),驴乳作用于角质形成细胞后,DEGs 参与的生物学过程主要有角化、表皮发育、皮肤发育、角质细胞分化、表皮细胞分化、细胞因子产生正调控、平滑肌细胞增殖正调控和血管内皮生长因子产生正调控等,富集的细胞组分包括角化套膜,富集的分子功能主要包括受体配体活性、细胞因子活性、碳水化合物跨膜转运蛋白活性、RAGE(Receptor for Advanced Glycation-End products,晚期糖基化终产物受体)受体结合、细胞因子受体结合、生长因子受体结合、错误折叠的蛋白质结合、跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶结合和通道活性等。表明,驴乳可能对表皮末端分化、角化、皮肤发育与衰老等功能方面具有一定的提升功效。

图2 差异表达基因的GO 功能富集分析(前10)

GO 功能富集结果显示见图2(b),驴乳作用于成纤维细胞后,DEGs 参与的生物学过程主要有有机羟基化合物转运、白细胞稳态、脂质定位的调节、激素代谢过程、对铁离子的反应、细胞黏附的正调控、T 细胞活化的调节和脂质转运的调节等,富集的细胞组分包括突触后膜、钾通道复合物、轴突、离子通道复合物和跨膜转运蛋白复合体等,富集的分子功能包括细胞因子活性、受体配体活性、延迟整流钾通道活性、Wnt-蛋白质结合、铁离子结合、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性和单加氧酶活性。可见,驴乳具有参与成纤维细胞发育、调控细胞因子活性、黑色素以及脂质转运的潜在功能。

2.4 差异表达基因KEGG 富集分析

为进一步研究驴乳作用皮肤细胞后DEGs 参与的代谢通路,对所有DEGs 进行了KEGG 富集分析。图3为驴乳作用皮肤细胞涉及的信号通路的气泡图。结果显示,驴乳作用于角质形成细胞后的DEGs 参与了IL-17信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、雌激素信号通路、卵巢类固醇生成、金黄色葡萄球菌感染和TNF信号通路等通路见图3(a);驴乳作用于成纤维细胞后的DEGs 参与了细胞因子-细胞因子受体相互作用、卵巢类固醇生成、耶尔森氏菌感染、色氨酸代谢、类固醇激素生物合成、cGMP-PKG 信号通路、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用等通路见图3(b)。

图3 差异表达基因的KEGG 功能富集分析(前10)

在健康皮肤中,IL-17 通过驱动上皮细胞分泌炎性细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶和抗微生物肽,在维持屏障功能、修复上皮损伤和防御细菌和真菌的侵袭发挥着重要的作用[15]。研究发现,IL-17 能够促使角质形成细胞产生趋化因子(CXCL1、CXCL2 和CXCL8),募集中性粒细胞向表皮聚集,在伤口愈合的早期阶段发挥作用[16];增加抗微生物肽(S100A8 和LC N2)的表达,介导屏障表面的微生物防御[17];诱导角质形成细胞产生基质金属蛋白酶(MMP),促进角质形成细胞迁移,参与正常组织重塑和伤口愈合[18]。KEGG 信号通路富集结果显示,驴乳激活角质形成细胞的CXCL1、CXCL2、CXCL8 和CCL20 等趋化因子,IL-6、COX2 等炎性细胞因子,S100A7、S100A8、S100A9 和LCN2 等抗菌肽,以及MMP- 1 和MMP-9 等的分泌。可见,驴乳在维持皮肤屏障功能、抵御细菌和真菌侵袭、促进伤口愈合方面有着重要的作用。

特应性皮炎的发病过程与致病菌的定植有关,金黄色葡萄球菌是特应性皮炎的主要病原菌[19]。研究发现,特应性皮炎患者皮损部位金黄色葡萄球菌的检出率显著高于非皮损部位,健康人群未检出金黄色葡萄球菌[20]。驴乳作用于角质形成细胞后,KEGG 通路富集结果显示,驴乳参与金黄色葡萄球菌感染信号通路,这可能为局部使用母乳治疗尿布疹、特异性湿疹提供了可能的作用机制。

细胞内环磷酸鸟苷酸(cGMP)是调节黑色细胞色素沉着的重要二级信使。研究发现,外界刺激比如紫外线辐射或原卟啉IX 能够直接激活鸟苷酸环化酶,增加细胞内cGMP 水平,进而激活PKG(蛋白激酶G),PKG 可通过间接激活CREB 信号通路或者直接通过酪氨酸酶促进黑色素生产[21-22]。驴乳作用于成纤维细胞的KEGG 通路富集结果显示,cGMP-PKG 信号通路中ADRA2C、ADRA1B、ADCY2、MEF2B、CUCY1A1等基因下调。据此推测,驴乳可能通过抑制cGMPPKG 信号通路的表达发挥减少面部黑色素的作用,为后续探究驴乳提亮肤色的分子机制提供思路,也从分子角度解释了乳及乳制品减少面部色素的原因。

3 结论

本研究利用RNA-seq 绘制了角质形成细胞和成纤维细胞受驴乳作用的基因差异表达谱。与空白对照相比,驴乳作用角质形成细胞后,共有819 个差异表达基因,其中420 个上调基因,399 个下调基因。这些差异基因主要涉及角化、表皮发育、角质细胞分化、角化套膜、IL-17 信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、金黄色葡萄球菌感染和TNF 信号通路等基因功能和信号通路。驴乳作用成纤维细胞后,共有507个差异表达基因,其中298 个基因上调,209 个基因下调。这些差异基因主要涉及细胞黏附、白细胞稳态、细胞因子活性、细胞因子-细胞因子受体相互作用、色氨酸代谢和cGMP-PKG 信号通路等基因功能和信号通路。为阐明驴乳对皮肤细胞结构、功能和健康的分子作用机制提供科学依据。

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